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    日本血吸蟲熱休克蛋白70在昆蟲細(xì)胞Sf9中的表達(dá)鑒定

    2013-07-04 07:23:36徐瑞敏李運(yùn)燕段明明苑純秀楊健美馮新港
    關(guān)鍵詞:桿狀病毒血吸蟲昆蟲

    徐瑞敏,李運(yùn)燕,2,段明明,劉 群,2,苑純秀,楊健美,馮新港

    (1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200241; 2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234)

    日本血吸蟲病是一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的寄生蟲病,至今仍然嚴(yán)重影響我國人、畜的健康和經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展[1]。安全有效的疫苗的成功開發(fā)與應(yīng)用是最終實(shí)現(xiàn)控制血吸蟲病目標(biāo)的技術(shù)保障[2]。目前,公認(rèn)的具有較高的保護(hù)性效果的疫苗是輻照致弱的尾蚴或童蟲疫苗RAV(radiation attenuated vaccine)[3],但由于材料來源和安全性等問題,RAV仍未推廣應(yīng)用。一般認(rèn)為,通過模擬RAV的效應(yīng)機(jī)制來開發(fā)血吸蟲疫苗可能是一條值得探索的新途徑。盡管對(duì)RAV誘導(dǎo)的宿主產(chǎn)生的高保護(hù)性免疫應(yīng)答的機(jī)制有所了解,但RAV的蟲源性的分子基礎(chǔ)和機(jī)制仍然不明。據(jù)Hedstrom等[4]報(bào)道,SmHSP70為RA曼氏血吸蟲疫苗的一種重要的免疫原;Yang 等[5]通過應(yīng)用蛋白質(zhì)組技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組比較紫外致弱的日本血吸蟲尾蚴轉(zhuǎn)化來的童蟲的SjHSP70呈現(xiàn)高表達(dá),他們研究小組進(jìn)一步將含SjHSP70分子的DNA疫苗免疫小鼠,發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生偏向于Th1的免疫應(yīng)答,且產(chǎn)生了一定的抗血吸蟲攻擊感染的免疫保護(hù)效果[6]。我們的前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示,SjHSP70在輻照日本血吸蟲尾蚴轉(zhuǎn)化來的童蟲(4 d和7 d)細(xì)胞表面呈高表達(dá);另一個(gè)應(yīng)急分子鈣網(wǎng)蛋白SjCRT在RA血吸蟲童蟲(7 d)來源細(xì)胞中也呈高表達(dá),且可以刺激小鼠樹突細(xì)胞(DC)表型的成熟[7]。因此我們推斷:在RAV模型中,血吸蟲的應(yīng)急分子如熱休克蛋白70(SjHSP70)、鈣網(wǎng)蛋白(SjCRT)以及高遷移蛋白1(SjHMGB1)等可能在活化宿主的抗原提呈細(xì)胞如DC、極化CD4+T細(xì)胞、以及增強(qiáng)RAV的免疫原性等方面發(fā)揮了重要的作用。

    為實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)SjHSP70是否具有上述免疫生物學(xué)功能,必需獲得一定數(shù)量的蟲源的或是重組的SjHSP70蛋白。由于蟲體材料來源受到極大地限制,故一般采用原核或真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來獲得目的蛋白。已報(bào)道的血吸蟲SjHSP70蛋白免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)使用的都是原核表達(dá)的重組蛋白,或直接使用DNA疫苗劑型[5],考慮到原核表達(dá)重組蛋白可能帶來內(nèi)毒素的污染,從而有可能影響對(duì)SjHSP70相關(guān)的免疫學(xué)功能的評(píng)價(jià)。本研究利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),在真核細(xì)胞Sf9中表達(dá)了SjHSP70,為進(jìn)一步研究SjHSP70免疫學(xué)特征及其在RAV模型中所發(fā)揮的作用等提供材料。

    1 材料與方法

    1.1 菌株、載體和細(xì)胞日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫、桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTA及其野生型毒株、Sf9 昆蟲細(xì)胞、DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京天根生物科技有限公司。

    1.2 主要試劑ExTaq聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ、T4 DNA連接酶、DNA純化試劑盒及小型質(zhì)粒抽提試劑盒均購自購自大連寶生物工程有限公司;DNA分子標(biāo)準(zhǔn)物購自北京天根生物科技有限公司;蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)物購自麥約爾生物技術(shù)有限公司;ODYSSEY anti-Mouse IRDye 800CW購自上海儀濤生物有限公司;Ni-NTA His-Bind 樹脂、Ni-NTA緩沖液試劑盒、昆蟲細(xì)胞裂解液購自Novagen公司;LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、SF900 Ⅲ無血清培養(yǎng)基、FBS、Alexa Fluor@488 goat anti-mouse IgG(H+L)購自上海Invitrogen 公司;SjHSP70原核表達(dá)蛋白[8]及該蛋白免疫鼠源血清、血吸蟲感染鼠的陽性血清均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

    1.3 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank(登錄號(hào):AY813185)的SjHSP70基因序列設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增該基因全長序列,其中:上游引物: 5'- CGGGATCCA TGTCTCGTAACTTGTTGTTA-3'; 下 游 引 物: 5'-CCGGAATTCTTACTGCTTCTC; CTGTTTAG -3'。上下游引物的5'端分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),引物由上海Invitrogen公司合成。以日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,PCR 程序設(shè)定:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性 45 s,55℃退火 45 s,72℃延伸 2 min,35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min,4℃保存;將擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,按照DNA純化試劑盒操作進(jìn)行產(chǎn)物純化回收。

    1.4 pFastBacHTA-SjHSP70轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建純化后的PCR 產(chǎn)物和pFastBacHTA載體用BamHⅠ和EcoRⅠ37℃雙酶切后分別純化回收,T4 DNA 連接酶、16℃恒溫水浴鍋過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂板,37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜,挑克隆過夜培養(yǎng),取菌液進(jìn)行PCR鑒定,陽性者再抽質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,并送至上海桑尼公司科技有限公司測序。陽性質(zhì)粒命名為pFastBacHTA-SjHSP70。

    1.5 重組穿梭質(zhì)粒reBacmid-SjHSP70的構(gòu)建和鑒定將重組的pFastBacHTA-SjHSP70質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH10Bac細(xì)胞,涂布于X-gal培養(yǎng)板,37℃倒置培養(yǎng)24~48 h,通過藍(lán)白斑篩選出陽性克隆,經(jīng)SjHSP70特異性引物及Bac-To-Bac桿狀病毒載體通用引物[7]兩次PCR鑒定穿梭質(zhì)粒reBacmid-SjHSP70。按照質(zhì)粒抽提試劑盒操作手冊(cè)提取重組桿狀病毒穿梭載體reBacmid-SjHSP70。

    1.6 reBacmid-SjHSP70轉(zhuǎn)染 Sf9昆蟲細(xì)胞將 2 μL重組質(zhì)粒和 5 μL 脂質(zhì)體分別加入 100 μL Grace's Insect培養(yǎng)基中稀釋混勻,室溫下孵育30 min。加入800 μL SF900 Ⅲ無血清培養(yǎng)基,混勻后轉(zhuǎn)染處于對(duì)數(shù)生長期的Sf9昆蟲細(xì)胞,27℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h后,去除轉(zhuǎn)染液加入2 mL SF900 Ⅲ完全培養(yǎng)基(含10%FBS)。72 h后收集上清作為第1代重組病毒,經(jīng)3次傳代得到高效價(jià)的重組桿狀病毒為種毒株。

    1.7 重組SjHSP70蛋白的檢測

    1.7.1 間 接 免疫熒光(Indirect Immunofluorescent Assay,IFA)檢測 用上述重組桿狀病毒毒株于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中感染Sf9細(xì)胞48 h,-20℃甲醇固定20 min。以原核表達(dá)的SjHSP70蛋白免疫BALB/c小鼠制備的血清一抗 37℃孵育 1 h ,PBST 洗滌 5 次,Alexa Fluor@488 goat anti-mouse IgG(H+L) 二 抗 孵 育45 min,PBST洗滌5次,熒光顯微鏡下觀察熒光反應(yīng)。

    1.7.2SjHSP70蛋白的純化及純化蛋白的Western blot分析 重組桿狀病毒毒株大量轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,48 h后收集細(xì)胞,263×g離心 10 min,取沉淀,加入昆蟲細(xì)胞裂解液,室溫裂解10 min,725×g離心10 min,取上清。按照Ni-NTA His-Bind純化操作手冊(cè)純化目的蛋白,將純化的SjHSP70重組蛋白SDSPAGE電泳,轉(zhuǎn)膜封閉過夜。以感染日本血吸蟲42 d的小鼠陽性血清作一抗,室溫孵育3 h,PBST洗滌5 次,ODYSSEY anti-Mouse IRDye 800CW 作二抗,室溫孵育45 min,PBST洗滌5次,雙色紅外激光成像儀成像。

    2 結(jié)果

    2.1 pFastBacHTA-SjHSP70轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建以日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫為模板,PCR 擴(kuò)增出一條大小約為1962 bp的目的條帶,與預(yù)期基因大小一致(圖1);將其與pFastBacHTA載體連接轉(zhuǎn)化,經(jīng)菌液PCR、雙酶切(圖1)及測序簽定pFastBacHTA-SjHSP70重組載體構(gòu)建成功。

    圖1 SjHSP70基因的PCR擴(kuò)增(A)和pFastBacHTASjHSP70轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建及雙酶切鑒定Fig.1 The amplifi cation of SjHSP70 gene by PCR and the restriction enzyme analysis of recombinant transferring vector pFastBacHTA-SjHSP70

    2.2 重組穿梭質(zhì)粒 reBacmid-SjHSP70的構(gòu)建將重組的pFastBacHTA-SjHSP70轉(zhuǎn)化至DH10Bac細(xì)胞,獲得重組穿梭質(zhì)粒reBacmid-SjHSP70。以reBacmid-SjHSP70為模板,用SjHSP70基因特異性引物進(jìn)行PCR,擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1962 bp,用Bac-To-Bac桿狀病毒載體通用引物,擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為4392 bp,其中2430 bp為桿狀病毒序列(圖2),表明重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    圖2 重組穿梭質(zhì)粒reBacmid-SjHSP70的PCR鑒定Fig.2 Identifi cation of recombinant bacubvirus reBacmid-SjHSP70 by PCR

    2.3 間接免疫熒光(IFA)檢測SjHSP70蛋白在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)用原核表達(dá)的SjHSP70蛋白免疫BALB/c小鼠制備的血清做一抗,IFA檢測SjHSP70蛋白在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)情況,結(jié)果表明,reBacmid-SjHSP70重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞能產(chǎn)生特異性的綠色熒光,而pFastBacHTA空載體感染Sf9細(xì)胞未出現(xiàn)熒光反應(yīng)(圖3),說明SjHSP70蛋白在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。

    圖3 IFA分析SjHSP70在Sf9細(xì)胞中表達(dá)(×200)Fig.3 The expression of SjHSP70 by IFA in Sf9 cells

    2.4 SjHSP70蛋白的純化將His柱純化的SjHSP70重組蛋白SDS-PAGE電泳,可見一條大小約為72 kDa的單一條帶(圖4),分子量與預(yù)期大小相符。轉(zhuǎn)染12個(gè)75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶Sf9細(xì)胞可得到約800μg純度較高的蛋白。

    圖4 SDS-PAGE電泳分析SjHSP70蛋白的純化Fig.4 Identifi cation of Purifi ed SjHSP70 protein by SDS-PAGE analysis

    2.5 純化蛋白的Western blot分析純化的SjHSP70蛋白SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜封閉。以感染日本血吸蟲42 d的小鼠陽性血清作一抗,Western blot結(jié)果顯示大小約為72 kDa的單一條帶(圖5),表明在Sf9細(xì)胞中表達(dá)的SjHSP70蛋白可被日本血吸蟲感染的鼠的陽性血清識(shí)別,具有較好的免疫原性。

    圖5 Western blot分析SjHSP70蛋白的免疫原性Fig.5 Immunogenicity analysis of SjHSP70 by Western blot

    3 討論

    對(duì)細(xì)菌、真菌、原蟲和哺乳動(dòng)物等物種的熱休克蛋白進(jìn)行的大量研究顯示[9,10],熱休克蛋白70(HSP70)是一類結(jié)構(gòu)十分保守的分子,一般由3個(gè)功能上不同的結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成,即N-端ATP酶結(jié)構(gòu)域、肽結(jié)合結(jié)構(gòu)以及C-端結(jié)構(gòu)域[11]。HSP70具有多種生物學(xué)功能,除作為分子伴侶參加蛋白分子的折疊和去折疊功能外[11],還具有激活先天免疫系統(tǒng)(包括巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的活化以及樹突細(xì)胞的活化與成熟等)、參與抗原提呈和交叉提呈以及自身免疫和抗腫瘤免疫等功能[12]。特別是在各種應(yīng)急條件(如環(huán)境的紫外輻照、病理的感染等)刺激下出現(xiàn)在胞外的HSP70分子,在活化先天免疫系統(tǒng)中起到十分重要的作用,HSP70分子既可以像“危險(xiǎn)”信號(hào)一樣直接刺激先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞,又可以通過與其結(jié)合的所謂的“伴侶肽”形成的復(fù)合物來增強(qiáng)伴侶肽抗原被APC(如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)的處理和提呈能力[13]。

    日本血吸蟲的SjHSP70分子是否也具有活化宿主樹突細(xì)胞和增強(qiáng)其伴侶肽被DC處理及提呈的功能,從而在RA血吸蟲疫苗中發(fā)揮了重要作用,有待我們進(jìn)一步驗(yàn)證。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,來源于細(xì)菌的脂多糖可通過TLR2或TLR4等信號(hào)受體介導(dǎo)的途徑激活宿主的DC形成Th1應(yīng)答環(huán)境[14],這與已報(bào)道的一些細(xì)菌和原蟲的HSP70誘生的免疫應(yīng)答的功能和機(jī)制相類似[15]。因此,為排除脂多糖的干擾,最好采用真核表達(dá)的SjHSP70為材料來開展相關(guān)的工作。在本實(shí)驗(yàn)中,我們采用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了含SjHSP70的真核表達(dá)載體,在昆蟲細(xì)胞Sf9中成功表達(dá)了SjHSP70分子。我們用分離純化的蛋白進(jìn)行了Western blot分析,確定了表達(dá)的蛋白具有較好的抗原性。另外,我們發(fā)現(xiàn),用該系統(tǒng)表達(dá)的目的蛋白經(jīng)純化后的得率相對(duì)較高,可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求,而用該系統(tǒng)表達(dá)的蜱來源的某些蛋白的得率很低[16],這可能與目的蛋白的理化特性有關(guān)。采用本實(shí)驗(yàn)得到的重組SjHSP70刺激小鼠DC成熟的研究正在進(jìn)行中。

    總之,本研究在真核細(xì)胞Sf9中成功表達(dá)了SjHSP70,同時(shí)純化和鑒定了重組蛋白,為進(jìn)一步研究SjHSP70活化宿主DC等免疫學(xué)功能提供了材料。

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