沙利度胺聯(lián)合替尼泊苷對(duì)人胃腺癌移植瘤生長(zhǎng)的影響

高 明趙 丹張自森馬 望張明智*

（1 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450052；2 鄭州市第三人民醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450000；3 鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 鄭州 450000）

沙利度胺聯(lián)合替尼泊苷對(duì)人胃腺癌移植瘤生長(zhǎng)的影響

高 明1趙 丹2張自森3馬 望1張明智1*

（1 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450052；2 鄭州市第三人民醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450000；3 鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 鄭州 450000）

目的 探討沙利度胺聯(lián)合替尼泊苷在對(duì)胃腺癌BGC-823裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及腫瘤細(xì)胞周期的影響，了解二者聯(lián)合對(duì)移植瘤的抑制作用。方法 建立人胃腺癌BGC823移植瘤模型，實(shí)驗(yàn)分組，計(jì)算抑瘤率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期及凋亡情況。結(jié)果 沙利度胺聯(lián)合替尼泊苷組腫瘤組織S期細(xì)胞比例明顯下降，大量腫瘤細(xì)胞阻滯于G2/M期，并可見明顯凋亡峰。結(jié)論 替尼泊苷聯(lián)合沙利度胺對(duì)抑制人胃腺癌BGC823細(xì)胞生長(zhǎng)具有協(xié)同作用，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

沙利度胺；替尼泊苷；胃腺癌

胃癌發(fā)病率在惡性腫瘤中非常高，病死率僅次于肺癌排在第二位[1]。早期診斷比較困難，確診時(shí)大多數(shù)患者已沒有手術(shù)機(jī)會(huì)，主要治療手段是以化療為主的綜合治療，有效率較低，現(xiàn)沒有標(biāo)準(zhǔn)治療方案[2]。體外研究發(fā)現(xiàn)替尼泊苷(VM-26)對(duì)人胃腺癌BGC-823細(xì)胞具有良好的抑制生長(zhǎng)作用[3]。近年來(lái)沙利度胺的動(dòng)物及體外實(shí)驗(yàn)表明其有抑制血管生成等作用，再度受到重視。

1 材料與方法

1.1 材料

①細(xì)胞株：人胃腺癌細(xì)胞系BGC-823購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。②實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6周齡、BALB/c裸鼠50只，雌雄各半，購(gòu)自中國(guó)藥品生物鑒定所嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心。③藥物：沙利度胺片（50mg/片）由常州制藥饋贈(zèng)；替尼泊苷注射液由美國(guó)百時(shí)美施貴寶公司饋贈(zèng)

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法

人胃腺癌細(xì)胞BGC-823在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中生長(zhǎng)。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

①荷瘤裸鼠模型的建立：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化，加入無(wú)血清培養(yǎng)基后離心；應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL；每只裸鼠接種1×106（約0.2mL）；②隨機(jī)分組：50只裸鼠成瘤率100%，隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組、沙利度胺組、低劑量VM-26組、高劑量VM-26組及低劑量VM-26聯(lián)合沙利度胺組。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組

成瘤后瘤徑達(dá)5mm時(shí)開始給藥；VM-26取2.45mg/kg、1.63mg/kg分別作為高劑量及低劑量組實(shí)驗(yàn)用藥劑量；沙利度胺組采用200mg/(kg·d)作為實(shí)驗(yàn)組用藥劑量。①空白對(duì)照組：尾靜脈注射0.2mL生理鹽水；②沙利度胺單藥組：經(jīng)口灌胃沙利度胺200mg/(kg·d)，每日給藥一次；③VM-26高劑量組：尾靜脈注射VM-26注射液2.45mg/kg，每周給藥一次；④VM-26低劑量組：尾靜脈注射替尼泊苷注射液1.63mg/kg，每周給藥一次；⑤沙利度胺聯(lián)合VM-26低劑量組：經(jīng)口灌胃沙利度胺200mg/(kg·d)，每日給藥1次；尾靜脈注射VM-26注射液1.63mg/kg，每周給藥1次；分組后次日開始給藥，連續(xù)2周。

1.2.4 計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率

在用藥前稱裸鼠的體質(zhì)量，與停藥次日處死動(dòng)物，剝出瘤塊稱重，計(jì)算瘤重抑制率。瘤重抑制率=（對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重）/對(duì)照組瘤重×100%。

表1 各治療組抑制腫瘤作用

表2 各治療組對(duì)人胃腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

剝出瘤塊制成組織標(biāo)本-80℃冰箱低溫保存，分別制備各組單細(xì)胞懸液后，將制備好的膠原蛋白酶溶液2mL加入離心管中；將離心管放入37℃恒溫水浴箱消化30min，后收集細(xì)胞懸液過(guò)濾、離心再加入PBS 2mL充分混勻，再加入0.5mL PBS重懸細(xì)胞；加入預(yù)冷的70%冷乙醇，放置4℃固定12h。檢測(cè)時(shí)加入RNA酶進(jìn)行消化，37℃水浴約30min后冰浴，采用碘化丙錠（PI）一步插入性DNA定量熒光染色。每一份樣品中約加入DNA染液1.0mL，放入4℃避光染色30min，過(guò)濾后制成單細(xì)胞懸液，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期，同時(shí)設(shè)二抗的本底對(duì)照和陰性對(duì)照。使用Expo32 ADC進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析，Muticycle AV分析軟件分析細(xì)胞周期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤生長(zhǎng)抑制情況

所有裸鼠接種細(xì)胞48h左右接種部位均可觸及米粒大小結(jié)節(jié)，約5d后明顯成瘤，測(cè)量瘤體積；空白對(duì)照組及各治療組在用藥第1周內(nèi)，瘤體生長(zhǎng)均較緩慢；其后空白對(duì)照組移植瘤瘤體呈現(xiàn)迅速生長(zhǎng)，而治療組移植瘤瘤體生長(zhǎng)仍較緩慢，以高劑量VM-26組最為顯著，其次為聯(lián)合用藥組；具體各組移植瘤情況見表1。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞周期及凋亡情況

流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示G2/M期細(xì)胞的阻滯在不同劑量VM-26組而有所不同，低劑量VM-26組細(xì)胞阻滯作用很輕微，與空白對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；相比之下，高劑量VM-26組可見明顯的G2/M期細(xì)胞阻滯，與空白對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；結(jié)果提示VM-26對(duì)胃癌細(xì)胞的阻滯作用是劑量依賴性的。本實(shí)驗(yàn)還觀察到沙利度胺組也有一定程度的G2/M期細(xì)胞阻滯作用，與空白對(duì)照組相比同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而聯(lián)合用藥組G2/M細(xì)胞的阻滯作用最為顯著，與空白對(duì)照組及沙利度胺組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；結(jié)果表明在降低替尼泊苷的劑量之后聯(lián)合沙利度胺對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)仍有明顯的抑制作用，對(duì)G2/M期細(xì)胞阻滯表現(xiàn)出協(xié)同作用；同時(shí)可見明顯的凋亡峰，提示二者的聯(lián)合可以分別通過(guò)不同的途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡（表2）。

3 討 論

VM-26和沙利度胺均可阻滯腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但作用的細(xì)胞周期不同。沙利度胺對(duì)腫瘤細(xì)胞的阻滯則主要表現(xiàn)在G1期。體外研究顯示VM-26可將口腔鱗癌細(xì)胞和人胃癌細(xì)胞阻滯于G2/M期[4,5]，同時(shí)認(rèn)為細(xì)胞周期的這種變化與細(xì)胞的凋亡有著十分密切的聯(lián)系。羅執(zhí)芬等[6]報(bào)道在相同摩爾濃度下，VM-26對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞的抑制率是依托泊甙的5倍以上。馬望等[7]報(bào)道VM-26和奧沙利鉑聯(lián)合用藥對(duì)抑制胃癌BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)有協(xié)同作用，并且VM-26與5-氟尿嘧啶聯(lián)合用藥對(duì)抑制胃癌BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)有相加作用。近年來(lái)，沙利度胺在實(shí)體腫瘤治療中的作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注。多項(xiàng)研究顯示[8]沙利度胺可以下調(diào)腫瘤細(xì)胞表面的VEGF和bFGF水平，抑制腫瘤血管形成，起抗腫瘤作用。此外沙利度胺還誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)IL-2的產(chǎn)生，提高NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用和抑制TNF-A的合成以及提高CD8+T細(xì)胞的增殖等作用，并且沙利度胺和化療的聯(lián)合已經(jīng)在臨床治療胃癌取得了不錯(cuò)的成績(jī)[9]。

本實(shí)驗(yàn)我們應(yīng)用替尼泊苷聯(lián)合沙利度胺作用于人胃腺癌移植瘤，流式細(xì)胞儀分析顯示，高劑量替尼泊苷組和聯(lián)合用藥組S期細(xì)胞比例不同程度下降，多數(shù)腫瘤細(xì)胞阻滯于G2期，而沙利度胺單藥組及低劑量VM-26單藥組與空白對(duì)照組相比S期細(xì)胞比例也有所下降，并且聯(lián)合用藥組G2/M細(xì)胞的阻滯作用最為顯著。結(jié)果表明替尼泊苷聯(lián)合沙利度胺對(duì)G2/M期細(xì)胞阻滯表現(xiàn)出協(xié)同作用，從而對(duì)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡起到協(xié)同作用，為臨床胃癌的治療提供了新的思路與理論支持。

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R735.2

B

1671-8194（2013）23-0058-02

河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)基金資助(項(xiàng)目編號(hào)：201203055)

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