酵母菌利用糖蜜發(fā)酵產(chǎn)麥角甾醇的工藝條件優(yōu)化

王紹杰，郭雪娜，何秀萍，張博潤(rùn)

1 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所酵母菌分子遺傳與育種實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

麥角甾醇是真菌細(xì)胞各種膜結(jié)構(gòu)的重要組成部分，它在確保膜結(jié)構(gòu)的完整性、流動(dòng)性、通透性、與膜結(jié)合酶的活性、細(xì)胞活力等方面具有重要的生理功能[1-3]。麥角甾醇還是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的代謝產(chǎn)物，是合成維生素D2的前體和生產(chǎn)可的松、黃體酮、蕓苔素內(nèi)酯和抗癌藥物等甾醇類藥物的重要原料[4-5]。酵母菌發(fā)酵法是國(guó)內(nèi)外麥角甾醇生產(chǎn)的主要方式。在眾多的酵母菌中，以釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae 麥角甾醇的含量最高，因而成為發(fā)酵法生產(chǎn)麥角甾醇的優(yōu)選菌種[6]。

酵母菌麥角甾醇產(chǎn)量同時(shí)受到細(xì)胞生長(zhǎng)速率和細(xì)胞麥角甾醇合成能力的影響，但野生型酵母菌細(xì)胞生長(zhǎng)和麥角甾醇合成之間常表現(xiàn)出一種相互制約的關(guān)系[7-9]。利用傳統(tǒng)的微生物育種技術(shù)，并結(jié)合代謝途徑的定向優(yōu)化，可以在一定程度上從菌種層面突破細(xì)胞生長(zhǎng)和麥角甾醇合成之間的相互制約，提高麥角甾醇產(chǎn)量[9-11]。同時(shí)通過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化也可以適當(dāng)協(xié)調(diào)細(xì)胞生長(zhǎng)和麥角甾醇合成之間的制約關(guān)系，實(shí)現(xiàn)麥角甾醇產(chǎn)量的提高。以葡萄糖和酵母粉等為主要原料的發(fā)酵條件優(yōu)化已有較多報(bào)道[8-10,12-13]。但通常情況下，發(fā)酵培養(yǎng)基約占發(fā)酵成本的50%，實(shí)現(xiàn)廉價(jià)、可再生原料的替代是新型發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)[14]。糖蜜作為制糖工業(yè)的副產(chǎn)物，富含蔗糖、葡萄糖和果糖等碳源，以及維生素和無(wú)機(jī)鹽，是發(fā)酵工業(yè)中一種經(jīng)濟(jì)易得的原料[15-16]。在我們前期研究中，對(duì)甘蔗糖蜜為主要原料的酵母菌發(fā)酵法生產(chǎn)麥角甾醇發(fā)酵條件進(jìn)行了初步分析[11]。

響應(yīng)面分析法(Response surface methodology,RSM)作為解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法，已應(yīng)用于多種發(fā)酵過(guò)程和生物反應(yīng)過(guò)程的優(yōu)化[16-18]。本研究將以甘蔗糖蜜為主要原料，通過(guò)響應(yīng)面分析獲得優(yōu)化培養(yǎng)基；在此基礎(chǔ)上進(jìn)行5 L 發(fā)酵罐的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)及發(fā)酵條件的進(jìn)一步優(yōu)化，以期為以糖蜜為主要原料的酵母菌發(fā)酵法生產(chǎn)麥角甾醇工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發(fā)酵菌種

釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae YEH56(pHXA42)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存[11]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

甘蔗糖蜜(含糖量為48%，總氮4.6%，總磷0.6%，Mg2+0.02%，Cu2+0.03%， Zn2+0.008%，F(xiàn)e2+0.06%，W/W)購(gòu)自北京市海昌鑫霖有限公司；玉米漿購(gòu)自北京保樂(lè)吉生物科技有限公司；麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母菌常規(guī)培養(yǎng)、保存及發(fā)酵用種子培養(yǎng)基YEPD 參照文獻(xiàn)[11]。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜83.3 g，磷酸1.68 g，尿素2.0 g，溶于蒸餾水中，用氫氧化鈉調(diào)pH 至5.4，定容至1000 mL。

優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜83.3 g，KH2PO41 g，K2HPO41.86 g，CuSO4.5H2O 17.5 mg，F(xiàn)eSO4.7H2O 13.9 mg，MgSO4.5H2O 12.3 mg，玉米漿10 mL，溶于蒸餾水中，調(diào)pH 至6.5，定容至1000 mL。

糖蜜流加補(bǔ)料發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基是將糖蜜濃度降低到41.6 g/L，KH2PO41 g，其他組分和pH 與優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基完全相同。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

從保存的菌種斜面上挑一環(huán)菌，轉(zhuǎn)接到50 mL YEPD 中，30℃、200 r/min 培養(yǎng)18 h；按10%(V/V)接種量將種子液轉(zhuǎn)接到裝45 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、200 r/min 培養(yǎng)36 h。

1.2.2 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

從保存的菌種斜面上挑一環(huán)菌，轉(zhuǎn)接到5 mL YEPD 液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min 培養(yǎng)16 h，然后轉(zhuǎn)接到200 mL YEPD 液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min 培養(yǎng)18 h，按10%(V/V)接種量轉(zhuǎn)接至裝有2 L 發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L 發(fā)酵罐(上海保興生物工程設(shè)備有限公司)中進(jìn)行發(fā)酵，溫度為30℃，轉(zhuǎn)速400 r/min，通氣量4 L/min，pH 控制在6.50左右。

進(jìn)行流加補(bǔ)料分批發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵罐初始裝液量為1.8 L 基礎(chǔ)培養(yǎng)基。補(bǔ)料液為含糖量為300 g/L的糖蜜，在發(fā)酵開始后5 h 以10 mL/h 的速度流加，從10 h 開始流加速度增加到20 mL/h，直到發(fā)酵結(jié)束為止。發(fā)酵12 h 前發(fā)酵條件控制同上；發(fā)酵12～30 h，轉(zhuǎn)速550 r/min，通氣量6 L/min，發(fā)酵末期恢復(fù)到初期轉(zhuǎn)速和通氣量。

1.2.3 分析方法

細(xì)胞生物量的測(cè)定和麥角甾醇的提取參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。細(xì)胞麥角甾醇含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。麥角甾醇產(chǎn)量指每升發(fā)酵液收獲的細(xì)胞所含的麥角甾醇的量(mg/L)，轉(zhuǎn)化率為每消耗1克糖蜜產(chǎn)生麥角甾醇的毫克數(shù)(mg/g)，麥角甾醇產(chǎn)率指每小時(shí)每消耗1克糖蜜產(chǎn)生的麥角甾醇毫克數(shù)(mg/(g·h))。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響麥角甾醇產(chǎn)量的顯著因素的篩選

依據(jù)單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果及影響酵母菌生長(zhǎng)代謝的一般因素，本研究選取糖蜜糖濃度(X1)、CuSO4(X2)、FeSO4(X3)、MgSO4(X4)、玉米漿(X5)、K2HPO4(X6)、KH2PO4(X7)、和pH (X8)為考察因素，并余留3個(gè)空白項(xiàng)以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差；每個(gè)因素設(shè)2個(gè)水平，以麥角甾醇產(chǎn)量(mg/L)為響應(yīng)值，進(jìn)行試驗(yàn)次數(shù)為N=12的Plackett-Burman 設(shè)計(jì)，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1，利用Design Expert 7.1.3軟件對(duì)表1中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)獲得的模型的“Prob (P)>F”為0.0024，說(shuō)明本試驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@著。該模型的決定系數(shù)和校正決定系數(shù)分別為0.9948和0.9811，說(shuō)明相關(guān)性良好。其中影響酵母菌麥角甾醇產(chǎn)量的顯著因素為CuSO4(P=0.0002)、K2HPO4(P=0.0301)和pH(P=0.0066)，其他被考察因素影響不顯著。

2.2 中心組合設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析

依據(jù) Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果和Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)原理，對(duì)篩選出的顯著影響麥角甾醇產(chǎn)量的 CuSO4(X1)、K2HPO4(X2)和初始pH(X3)三個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)，3因素取3水平共設(shè)計(jì)17組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。各因素水平及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

利用Design-Expert 7.1.3軟件對(duì)中心組合試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到以麥角甾醇產(chǎn)量為響應(yīng)值(Y)的擬合二次多項(xiàng)式回歸方程：Y=343.64+13.20X1-1.39X2+3.85X3+2.67X1X2-1.04X1X3+9.11X2X3-29.02X12-6.64X22-2.98X32。對(duì)回歸方程進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該模型極顯著(P＜0.0001)，多元相關(guān)系數(shù)R2=0.9805，說(shuō)明模型與實(shí)際情況擬合很好；在模型參數(shù)中，X1(CuSO4)對(duì)麥角甾醇產(chǎn)量的線性效應(yīng)極顯著(P＜0.0001)，X3(發(fā)酵起始pH)對(duì)麥角甾醇產(chǎn)量的線性效應(yīng)顯著(P=0.0316)，而X2(K2HPO4)對(duì)麥角甾醇產(chǎn)量的線性效應(yīng)不顯著(P=0.3668)。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Experimental design of Plackett-Burman and corresponding results

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of central composite design

對(duì)回歸方程求解，得到各因素的最適水平，即硫酸銅0.07 mmol/L、磷酸氫二鉀1.82 g/L 和pH為6.50，其他因素取Plackett-Burman 試驗(yàn)中的高水平，在此條件下利用模型預(yù)測(cè)麥角甾醇產(chǎn)量為348.40 mg/L。

2.3 優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性和有效性，在預(yù)測(cè)的最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次，3次試驗(yàn)麥角甾醇產(chǎn)量平均值為371.56 mg/L，預(yù)測(cè)精確度達(dá)到93.8%，說(shuō)明模型可靠。酵母菌麥角甾醇產(chǎn)量比優(yōu)化前(286.89 mg/L)提高了29.5%。

2.4 發(fā)酵罐發(fā)酵試驗(yàn)

利用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基在5 L 發(fā)酵罐中進(jìn)行分批發(fā)酵試驗(yàn)，比較了發(fā)酵過(guò)程pH 變化對(duì)麥角甾醇產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)pH 控制在6.5左右，麥角甾醇產(chǎn)量達(dá)最高，發(fā)酵38 h，細(xì)胞生物量為13.33 g/L、細(xì)胞麥角甾醇含量為45.15 mg/g、麥角甾醇產(chǎn)量為601.85 mg/L(圖1A)。與搖瓶試驗(yàn)相比，麥角甾醇產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率均提高了62.1%。

在分批發(fā)酵試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行了底物糖蜜流加補(bǔ)料發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵38 h，麥角甾醇產(chǎn)量為1953.85 mg/L，是分批發(fā)酵的3.2倍(圖1B)。其中流加補(bǔ)料發(fā)酵試驗(yàn)中糖蜜到麥角甾醇的轉(zhuǎn)化率為10.32 mg/g、麥角甾醇產(chǎn)率為0.28 mg/(g·h)，均比分批發(fā)酵提高了42.7%。

3 結(jié)論

圖1 酵母菌在5-L 發(fā)酵罐中批次發(fā)酵和底物流加發(fā)酵時(shí)間曲線Fig.1 Fermentation profiles of Saccharomyces cerevisiae in 5 L bioreactor.(A) Batch fermentation.(B) Fed-batch fermentation.

培養(yǎng)基組成是影響發(fā)酵成本和發(fā)酵效率的重要因素，利用廉價(jià)可再生的原料是發(fā)酵工業(yè)未來(lái)發(fā)展的重要趨勢(shì)，本研究以制糖工業(yè)副產(chǎn)物-糖蜜為主原料，綜合采用培養(yǎng)基配方優(yōu)化、發(fā)酵過(guò)程pH 恒定控制及底物流加補(bǔ)料策略，不但使麥角甾醇產(chǎn)量比前期報(bào)道提高了14.5%，而且生產(chǎn)效率提高了20.5%[11]。與以葡萄糖為主要發(fā)酵原料的研究報(bào)道[13]相比，麥角甾醇產(chǎn)量提高了20.2%。本研究為酵母菌發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)麥角甾醇的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了重要的參考依據(jù)。

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