聚乳酸微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上SH-SY5Y細(xì)胞VEGF和IL-8的分泌及表達(dá)

范志剛，林雨，黃豈平，羅美蓉，田青華，鐘冬火，馮全義，吳澤志

重慶大學(xué)生物工程學(xué)院 生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044

拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是體內(nèi)基質(zhì)環(huán)境及體外細(xì)胞培養(yǎng)基底中影響組織結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞的形態(tài)和功能最重要的物理因素之一[1-4]。早在1912年，Harrison等以蜘蛛網(wǎng)進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)即發(fā)現(xiàn)細(xì)胞會(huì)沿著培養(yǎng)基底的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行排列、形態(tài)取向和遷移，此即后來被稱為的“接觸引導(dǎo)”(Contact guidance)[5]。近一個(gè)世紀(jì)的研究已經(jīng)證實(shí)了拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞的接觸引導(dǎo)是眾多細(xì)胞類型的共同培養(yǎng)特征[6]，揭示了基底拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)在體外細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)領(lǐng)域的重要應(yīng)用前景。近十余年來，微加工技術(shù)領(lǐng)域新方法的出現(xiàn)及原有制備方法的改進(jìn)使得在眾多材料上制備出微米和亞微米級(jí)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)成為可能，這些為有關(guān)領(lǐng)域深入研究拓?fù)浠讞l件下培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)響應(yīng)乃至功能分化提供了條件。近年隨著細(xì)胞工程及細(xì)胞芯片相關(guān)領(lǐng)域的進(jìn)展，細(xì)胞與拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底相互作用的研究已經(jīng)越來越多地注重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞的功能響應(yīng)性及功能分化[7-10]。拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞功能響應(yīng)性及功能分化的研究是基底拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)在體外細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)、組織工程、細(xì)胞芯片和細(xì)胞微系統(tǒng)構(gòu)建以及仿生工程中應(yīng)用研究的前提。

對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞，三維及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)培養(yǎng)基底已經(jīng)被成功地應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)分化及突起延伸等[11]。近年的研究更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，三維及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)條件下神經(jīng)細(xì)胞的離子通道，如電壓依從式鈣離子通道 (Voltage-gated calcium channels，VGCCs)，較之二維平面基底時(shí)表現(xiàn)出不同的功能響應(yīng)性[12-14]。采用一種微球致密陣列拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底的研究表明，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底在特定的結(jié)構(gòu)條件下可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)鋪展并進(jìn)而增強(qiáng)VGCCs功能響應(yīng)性[12]。與此相反，在三維微小凹圖式上神經(jīng)細(xì)胞較之二維平面基底上鋪展程度減小，其VGCCs功能響應(yīng)性卻明顯降低[13-14]。這些發(fā)現(xiàn)促使人們尋找細(xì)胞于三維及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)培養(yǎng)條件下的標(biāo)志分子，尤其是分泌物標(biāo)志，及其與細(xì)胞功能表型的關(guān)系。建立神經(jīng)細(xì)胞在三維及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)培養(yǎng)條件下的分泌物標(biāo)志的意義是，分泌物標(biāo)志提供了細(xì)胞在三維或拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上特定生長(zhǎng)狀態(tài)的簡(jiǎn)易、快速而實(shí)用的評(píng)價(jià)手段。

細(xì)胞因子是可溶性低分子量蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡以及組織或植入體新生血管形成等有廣泛的調(diào)節(jié)作用。在神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞因子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞增殖及分化的調(diào)控已經(jīng)得到確認(rèn)，其分泌和表達(dá)是神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)與功能分化的重要標(biāo)志，因而也是神經(jīng)細(xì)胞在三維及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)條件下分泌物標(biāo)志的理想選擇。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)和白細(xì)胞介素-8 (IL-8)是調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞功能分化尤其是離子通道功能表達(dá)的重要細(xì)胞因子。使用三維組織工程支架材料進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，可以發(fā)現(xiàn)若干種細(xì)胞的VEGF和IL-8表達(dá)較之于二維條件出現(xiàn)上調(diào)[15]。Kisaalita等采用三維聚苯乙烯支架材料培養(yǎng)人神經(jīng)干細(xì)胞 H945RB.3，發(fā)現(xiàn)三維條件下神經(jīng)干細(xì)胞的VEGF和IL-8 mRNA表達(dá)水平顯著高于二維條件下的相應(yīng)值[16]。類似的研究結(jié)果也見于 RGD-藻酸鹽三維體系培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞[17]。上述分析表明VEGF和IL-8分泌及表達(dá)的上調(diào)可能是神經(jīng)細(xì)胞于三維及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)條件生長(zhǎng)和功能分化的分泌物標(biāo)志。

本文采用紫外光光刻、硅蝕刻及復(fù)制模塑技術(shù)，加工了微柱名義直徑為2 μm和4 μm、微柱名義間距為 2 μm 和 7 μm 的 4種聚乳酸(Poly-L-lactide，PLLA)微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底，在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了SH-SY5Y細(xì)胞在陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上的復(fù)合培養(yǎng)。作者進(jìn)一步評(píng)價(jià)了在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征以及VEGF和IL-8的分泌及表達(dá)行為，發(fā)現(xiàn)SH-SY5Y細(xì)胞在PLLA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上的VEGF和/或IL-8表達(dá)和分泌量相比平面結(jié)構(gòu)的相應(yīng)值出現(xiàn)上調(diào)，且這一表達(dá)和分泌量的上調(diào)伴隨細(xì)胞鋪展面積的明顯降低。上述結(jié)果表明微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是影響SH-SY5Y細(xì)胞VEGF和IL-8分泌及表達(dá)的重要微環(huán)境因素，VEGF和 IL-8有可能作為SH-SY5Y細(xì)胞在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)或三維微環(huán)境生長(zhǎng)的重要分泌物標(biāo)志。

1 材料與方法

1.1 PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底的制備

PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底的制備過程包括光掩模的設(shè)計(jì)及加工、紫外光光刻、硅蝕刻、以聚二甲基硅氧烷[Polydimethylsiloxane，PDMS(Sylgard 184，Dow Corning，美國(guó))]為基礎(chǔ)的復(fù)制模塑加工等過程。主模采用P<100>硅片 (電阻率7-13，北京有研半導(dǎo)體材料股份有限公司)進(jìn)行加工，PDMS負(fù)模的加工及復(fù)制模塑在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

研究中設(shè)計(jì)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底由圓形微柱陣列構(gòu)成，微柱名義直徑為2 μm和4 μm，名義高度4 μm，名義間距分別為2 μm和7 μm。在后文的敘述中將采用微柱名義直徑-微柱名義間距(μm)描述拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底，如2-2 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底。PDMS負(fù)模的制備參見前期PDMS微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底的制備方法[12]。將適量PLLA (相對(duì)分子量100 000，濟(jì)南岱罡生物科技有限公司)置于邊長(zhǎng)為12 mm的方形蓋玻片上，以加熱板(HP7，IKA，德國(guó)，廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司)加熱至130 ℃使PLLA呈熔融狀態(tài)，將PLLA在蓋玻片上涂布均勻。將 PDMS負(fù)模放置于PLLA上，以0.5 MPa的壓力施壓5 s，熔融狀態(tài)的PLLA將依靠虹吸作用滲入PDMS的微結(jié)構(gòu)間隙，室溫冷卻1 min后，在酒精中浸泡1 min，剝離PDMS負(fù)模，即得PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底。PLLA二維平面基底的制備采用上述同樣方法，但以平整硅片代替主模分別制備PDMS平面基底和 PLLA二維平面基底[18]。制備的PLLA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底及PLLA二維平面基底經(jīng)紫外光照射 1 h滅菌，再以小牛血清裱襯1 h待用。

1.2 SH-SY5Y細(xì)胞的培養(yǎng)

SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞購(gòu)買于American Type Culture Colection，以35 cm2培養(yǎng)瓶 (Corning，美國(guó)) 在 37 ℃、5% CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基由DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó)) 添加 10%熱滅活胎牛血清(GIBCO，美國(guó))、100 U/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素 (Sigma，美國(guó))構(gòu)成。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到75%的融合度時(shí)，采用濃度 0.25%的胰蛋白酶(Hyclone，美國(guó))消化并以機(jī)械吹打法收集細(xì)胞，以完全培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸浮液。將上述PLLA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底及 PLLA二維平面結(jié)構(gòu)置放入35 mm2的平面培養(yǎng)皿 (FALCON，美國(guó))中。將約0.2 mL細(xì)胞懸液接種于放置于平面培養(yǎng)皿中的PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底或PLLA平面二維結(jié)構(gòu)上，細(xì)胞接種密度約 1×104個(gè)/mL。樣本靜置 1 h后補(bǔ)充加入完全培養(yǎng)基 1 mL，于37 ℃、5% CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 掃描電子顯微鏡制樣及觀察

PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底及培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3次，以2.5%戊二醛 (pH 7.2～7.4)在4 ℃固定過夜，再用0.9%的生理鹽水洗滌2次，每次5 min。分別使用30%、50%、70%、80%、95%和 100% (2次)的乙醇進(jìn)行梯度脫水，每步5 min。樣品進(jìn)一步使用50%、70%、90%、95%和100% (2次)的叔丁醇進(jìn)行梯度脫水，每步5 min。樣本經(jīng)自然干燥后，濺射涂膜鍍金3～5 次，每次20 s。掃描電鏡照片的拍攝采用掃描電子顯微鏡 (HITACHI S-3400N，日本)進(jìn)行，加速電壓設(shè)置為15 kV。

掃描電鏡照片中細(xì)胞形態(tài)鋪展的評(píng)價(jià)采用Image J軟件進(jìn)行測(cè)量。周長(zhǎng)及投影面積的測(cè)量依據(jù)所描繪的包括細(xì)胞胞體和片足的輪廓。細(xì)胞圓度=4×π×投影面積/ (周長(zhǎng))2。

1.4 細(xì)胞骨架免疫熒光染色

實(shí)驗(yàn)中以鬼筆環(huán)肽 (Phalloidin) 進(jìn)行微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底及二維平面基底上細(xì)胞肌動(dòng)蛋白微絲的免疫熒光染色。SH-SY5Y細(xì)胞接種于微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底及二維平面基底 24 h后，依次使用 4%多聚甲醛固定 40 min，0.5%Triton X-100破膜5 min，再使用1%山羊血清蛋白室溫條件下封閉細(xì)胞 1 h。樣品經(jīng)用濃度為5 μg/mL 的 FITC-phalloidin (Sigma，美國(guó))于4 ℃染色過夜。樣品進(jìn)一步采用濃度為10 μg/mL的 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色液 (碧云天生物技術(shù)研究所，江蘇)進(jìn)行細(xì)胞核染色15 min。上述染色步驟間細(xì)胞均以PBS清洗3遍，每次5 min。封片后用激光共聚焦掃描顯微鏡 (Leica Sp5，德國(guó))進(jìn)行觀察并拍照。鬼筆環(huán)肽以488 nm的Argon激光激發(fā)，以TD 488/543/633 nm的長(zhǎng)通濾片收集發(fā)射光；DAPI以405 nm的Diode激光激發(fā)，以基礎(chǔ)長(zhǎng)通濾片收集發(fā)射光。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng) (ELISA)

SH-SY5Y細(xì)胞接種于微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底及二維平面基底后，置于 12孔板中常規(guī)培養(yǎng)24 h后，更換無血清培養(yǎng)液。細(xì)胞經(jīng)無血清培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)液，以新鮮培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VEGF、IL-8的分泌量。ELISA試劑盒購(gòu)于北京四正柏公司，按供貨商提供的方法常規(guī)操作，用自動(dòng)酶標(biāo)儀分析儀(Model 680，Bio-Rad，美國(guó))讀取吸光值，以此進(jìn)行標(biāo)定并計(jì)算培養(yǎng)液中VEGF和IL-8濃度及分泌量。拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底及二維平面基底上的培養(yǎng)細(xì)胞用0.25%胰酶消化并分散后，用四甲基氮唑藍(lán) (Methylthiazolyl tetrazolium，MTT)法 (凱基生物科技發(fā)展有限公司，南京，中國(guó))檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量，以此進(jìn)行細(xì)胞分泌量的歸一化處理及統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

SH-SY5Y細(xì)胞在微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底及二維平面基底上培養(yǎng)24 h后，使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA (Bioteke，中國(guó))，以2 μg RNA為模板，采用PrimeScriptTMRT reagent kit (TaKaRa，日本)反轉(zhuǎn)錄試劑盒并參照生產(chǎn)商提供方法合成cDNA。采用SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，以GAPDH為內(nèi)參照，VEGF與IL-8為目的基因。引物序列見表1。在實(shí)時(shí)定量PCR儀 (Bio-Rad CFX96，美國(guó))進(jìn)行熒光定量 PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為：2×SYBR Premix Ex Taq Mix (TaKaRa，日本)10 μL，cDNA 模板 1 μL，上下游引物各1 μL，dH2O 7 μL。反應(yīng)參數(shù)為：95 5 s℃，55 20 s℃，72 10 s℃，39個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本均進(jìn)行3次生物學(xué)樣本重復(fù)，使用2-Ct△△法進(jìn)行計(jì)算分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

不同基底上細(xì)胞投影面積、細(xì)胞周長(zhǎng)、細(xì)胞圓度，細(xì)胞VEGF和IL-8分泌及表達(dá)量等結(jié)果采用±s (算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示。組間數(shù)據(jù)比較采用Student’s t-test，以P<0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

表1 VEGF、IL-8及內(nèi)參基因GAPDH的PCR引物序列Table 1 Primer sequence for VEGF, IL-8 and GAPDH

2 結(jié)果

2.1 SH-SY5Y細(xì)胞與PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底的復(fù)合

圖1為SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞接種于2-2 μm、2-7 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上生長(zhǎng)12 h后的相差顯微圖片。圖2是SH-SY5Y細(xì)胞在4種PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底和PLLA平面基底培養(yǎng) 24 h后的掃描電子顯微圖片及相差顯微圖片。從圖1和圖2中可見，在實(shí)驗(yàn)條件下使用紫外光光刻、硅蝕刻和復(fù)制模塑技術(shù)能夠制備結(jié)構(gòu)規(guī)整、清晰的微柱陣列型拓?fù)浠?，且各結(jié)構(gòu)尺寸均符合預(yù)期設(shè)計(jì)要求。相差顯微圖片顯示，在2-7 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上出現(xiàn)少量微柱結(jié)構(gòu)的斷裂缺失 (圖 1B)。這一現(xiàn)象可能是在復(fù)制模塑制備小微柱時(shí)由于負(fù)模剝離所致。在進(jìn)行掃描電子顯微制樣后，由于2-2 μm基底和2-7 μm基底微柱直徑較小，可以發(fā)現(xiàn)非細(xì)胞粘附區(qū)微柱有很大程度斷裂缺失，其中2-2 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底非細(xì)胞粘附區(qū)微柱幾乎完全斷裂或缺失，2-7 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底非細(xì)胞粘附區(qū)微柱部分?jǐn)嗔鸦蛉笔А＿@一現(xiàn)象可能是由電鏡制樣引起的結(jié)構(gòu)熔融或斷裂所致。

圖1 SH-SY5Y細(xì)胞在2-2 μm和2-7 μm PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上培養(yǎng)12 h后相差顯微鏡圖Fig. 1 Phase contrast microscopic images of SH-SY5Y human neuroblastoma cells interfaced with 2-2 μm and 2-7 μm poly-L-lactide pillar arrayed topographic substrate after 12 h of culture. Topographic substrates were represented by nominal pillar diameter-nominal spacing in micrometers. (A)2-2 μm topographic substrate. (B)2-7 μm topographic substrate; The insert on the left bottom of image (A)represents magnification of the boxed region to the right of the image.

圖2 SH-SY5Y細(xì)胞在4種微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底和PLLA平面基底上培養(yǎng)24 h后的掃描電子顯微圖和相差顯微鏡圖Fig. 2 Scanning electronic (SEM) and phase contrast microscopic images of SH-SY5Y human neuroblastoma cells interfaced with PLLA flat and micropillar arrayed topographic substrates after 24 h of culture. Topographic substrates were represented by nominal pillar diameter-nominal spacing in micrometers. Images (A-D) show the SEM images for cells on topographic substrates. (A) 2-2 μm topographic substrate. (B) 2-7 μm topographic substrate. (C) 4-2 μm topographic substrate. (D) 4-7 μm topographic substrate. Image (E)shows the phase contrast microscopic image for cells on PLLA flat substrates.

從圖1和圖2中可見，本文制備的4種PLLA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底和 PLLA二維平面基底均可支持SH-SY5Y細(xì)胞的正常粘附生長(zhǎng)。在培養(yǎng)24 h后不同基底上的細(xì)胞表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)形態(tài)：在2-2 μm、4-2 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞形態(tài)與平面基底上細(xì)胞形態(tài)相似，表現(xiàn)為正常梭形或星形；在2-7 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞表現(xiàn)出較高的極化及形態(tài)分化趨勢(shì)，部分細(xì)胞出現(xiàn)長(zhǎng)的神經(jīng)突起；在4-7 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞形態(tài)卻趨向于圓形，少有神經(jīng)突起。為了定量考察PLLA微柱陣列型拓?fù)浠讓?duì)細(xì)胞形態(tài)的影響，我們采用Image J軟件對(duì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底和二維平面基底上培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)分析，測(cè)量細(xì)胞鋪展面積(投影面積)和周長(zhǎng)，并以此計(jì)算出細(xì)胞圓度(表 2)。從表2可以發(fā)現(xiàn)，在2-2 μm、2-7 μm、4-7 μm 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞鋪展面積顯著小于PLLA 平面基底上細(xì)胞的相應(yīng)值 (P＜0.01)；在4-2 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞的鋪展面積較PLLA平面基底上細(xì)胞趨于降低，但這一差異并不顯著(P＞0.05)。從表2還可以發(fā)現(xiàn)，在2-7 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞圓度為0.34±0.09 (n=57)，明顯小于 PLLA平面基底上的細(xì)胞圓度 0.40±0.10(n=66)(P＜0.01)；與此相反，在 2-2 μm、4-2 μm和4-7 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞圓度均大于PLLA平面基底上的相應(yīng)值 (P＜0.01)。上述形態(tài)測(cè)量結(jié)果表明，SH-SY5Y細(xì)胞在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上較之平面基底上鋪展程度趨于降低或明顯降低。在2-7 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞較之其余3種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底和平面基底上細(xì)胞較小的圓度值表明該拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞具有更高的極化程度和形態(tài)分化趨勢(shì)。

我們用 FITC-phalloidin對(duì)微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底及二維平面基底上SH-SY5Y細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白骨架進(jìn)行了免疫熒光染色。圖 3為SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)FITC-phalloidin染色的激光共

聚焦顯微照片。從圖中可見，在微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底及二維平面基底上SH-SY5Y細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的肌動(dòng)蛋白熒光染色，其中在平面基底及4-2 μm和2-7 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上可觀察到細(xì)胞中清晰的肌動(dòng)蛋白微絲結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞長(zhǎng)軸一致，貫穿整個(gè)細(xì)胞，止于細(xì)胞邊緣。微絲結(jié)構(gòu)在平面基底上SH-SY5Y細(xì)胞中最為明顯。而在2-2 μm、4-7 μm 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞無明顯的肌動(dòng)蛋白微絲結(jié)構(gòu)。

表2 SH-SY5Y細(xì)胞在PLLA平面基底和微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上的形態(tài)鋪展Table 2 Morphological spreading of SH-SY5Y human neuroblastoma cells interfaced with PLLA flat substrate and micropillar arrayed topographic substrates

圖3 SH-SY5Y細(xì)胞在PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底和平面基底上培養(yǎng)24 h后肌動(dòng)蛋白骨架染色的激光共聚焦顯微鏡圖Fig. 3 Confocal microscopic images of SH-SY5Y human neuroblastoma cells on PLLA micropillar arrayed topographic substrates and PLLA flat substrates stained for actin cytoskeleton 24 h after plating. Topographic substrates were represented by nominal pillar diameter-nominal spacing in micrometers. (A) 2-2 μm topographic substrate. (B)2-7 μm topographic substrate. (C) 4-2 μm topographic substrate. (D) 4-7 μm topographic substrate. (E) flat substrate.Actin cytoskeleton (green)was stained with FITC-phalloidin in a concentration of 5 μg/mL while cell nuclei (blue)were stained with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)in a concentration of 10 μg/mL.

2.2 SH-SY5Y細(xì)胞在PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底及PLLA二維平面基底上VEGF和IL-8蛋白的分泌水平

表3和表4分別為SH-SY5Y細(xì)胞在PLLA平面基底和微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上 VEGF及 IL-8分泌量的 ELISA檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行無血清培養(yǎng)24 h后，收集上清液檢測(cè)得VEGF、IL-8的分泌濃度，經(jīng)MTT法測(cè)得的細(xì)胞數(shù)目歸一化后即得兩種因子在24 h內(nèi)的分泌量。從表3中數(shù)據(jù)可見，與PLLA平面結(jié)構(gòu)上細(xì)胞VEGF分泌量[(10.15±2.9) pg/104cells]相比，SH-SY5Y細(xì)胞在2-7 m μ [(14.67±5.34) pg/104cells]和 4-7 μm [(18.91±8.8) pg/104cells]拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上的VEGF分泌量明顯增高(P＜0.05)，而在 2-2 μm和 4-2 μm 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞的VEGF分泌量則趨于增高 (P＞0.05)。從表 4可見，與 PLLA平面基底上細(xì)胞的 IL-8分泌量[(3.85±1.47)pg/104cells]相比，SH-SY5Y 細(xì)胞在2-2 μm [(8.33±2.32)pg/104cells]和 2-7 μm[(9.35±4.30)pg/104cells]拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上的IL-8分泌量明顯增高 (P＜0.05)，而在4-2 m μ 和4-7 m μ拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上的分泌量則趨于增高 (P＞0.05)。從上述結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)，SH-SY5Y細(xì)胞在本文所加工的4種PLLA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上的VEGF和/或IL-8分泌量較之PLLA平面結(jié)構(gòu)上明顯增高或趨于增高，其中在2-7 m μ 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上VEGF和IL-8的分泌量同時(shí)出現(xiàn)明顯的增高。

表3 SH-SY5Y細(xì)胞在PLLA平面基底和微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上VEGF的分泌量Table 3 Secretion of VEGF by SH-SY5Y human neuroblastoma cells interfaced with PLLA flat substrates and micropillar arrayed topographic substrates

表4 SH-SY5Y細(xì)胞在PLLA平面基底和微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上IL-8的分泌量Table 4 Secretion of VEGF by SH-SY5Y human neuroblastoma cells interfaced with PLLA flat substrates and micropillar arrayed topographic substrates

2.3 SH-SY5Y細(xì)胞在PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底及二維平面基底上 VEGF、IL-8的mRNA相對(duì)表達(dá)水平

我們采用SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞在PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底及 PLLA二維平面基底上 VEGF、IL-8的mRNA表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參基因并采用2-Ct△△法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，定量評(píng)價(jià) mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。圖 4為SH-SY5Y細(xì)胞在PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底及PLLA二維平面基底上VEGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量。從圖中可見，在4種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上SH-SY5Y細(xì)胞VEGF表達(dá)量較之PLLA平面基底上相應(yīng)表達(dá)量均出現(xiàn)大幅度明顯增高(P＜0.01)，且 4 種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底間細(xì)胞 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平并無明顯差異(P＞0.05)。圖5為SH-SY5Y細(xì)胞在 PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底及PLLA二維平面基底上IL-8的mRNA相對(duì)表達(dá)量。圖5所示結(jié)果表明，在2-7 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上SH-SY5Y細(xì)胞IL-8 mRNA表達(dá)量顯著高于PLLA平面基底上細(xì)胞的相應(yīng)表達(dá)量 (升高12.6倍，P＜0.01)，而在其余3種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞IL-8表達(dá)量?jī)H略高于PLLA平面基底上細(xì)胞的相應(yīng)表達(dá)量 (升高1.6～4.4倍，P＜0.05)。

圖4 SH-SY5Y細(xì)胞在PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底及二維平面基底上VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 Relative expression of VEGF mRNA by SH-SY5Y human neuroblastoma cells interfaced with PLLA flat substrates and micropillar arrayed topographic substrates.Values were presented as ±s of 3 measurements.Topographic substrates were represented by nominal pillar diameter-nominal spacing in micrometers. FLAT refers to two dimensional flat PLLA substrates. Measurements were carried out 24 h after culture in serum-free condition. The 2-△△Ct method was used to calculate the VEGF expression relative to GAPDH. Statistically significant difference probability values for comparison with that for cells on PLLA flat substrates: *P<0.01.

圖5 SH-SY5Y細(xì)胞在PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底及二維平面基底上IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig. 5 Relative expression of IL-8 mRNA by SH-SY5Y human neuroblastoma cells interfaced with PLLA flat substrates and micropillar arrayed topographic substrates.Values were presented as ±s of 3 measurements.Topographic substrates were represented by nominal pillar diameter-nominal spacing in micrometers. FLAT refers to two dimensional flat PLLA substrates.Measurements were carried out 24 h after culture in serum-free condition. The 2-△△Ct method was used to calculate the IL-8 expression relative to GAPDH.Statistically significant difference probability values for comparison with that for cells on PLLA flat substrates:*P<0.05, **P<0.01.

3 討論

相比傳統(tǒng)的培養(yǎng)皿制備方法，采用微加工技術(shù)制備細(xì)胞培養(yǎng)基底能夠精確控制基底材料在微米乃至亞微米級(jí)的結(jié)構(gòu)尺寸和材料特性，這使得系統(tǒng)研究基底微拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與細(xì)胞功能的相關(guān)性成為可能，在細(xì)胞微環(huán)境的工程化構(gòu)建中具有重要意義。文中制備陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底采用的紫外光光刻及復(fù)制模塑是微米級(jí)加工的成熟手段，具備大面積和大規(guī)模快速制備能力以及設(shè)備技術(shù)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，類似的方法已經(jīng)被用于制備高結(jié)構(gòu)或高縱橫比拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底[18]。另一方面，PLLA是在組織工程及臨床醫(yī)學(xué)中廣泛使用的生物可降解材料，其細(xì)胞相容性已經(jīng)被很多的研究所證實(shí)[19]，是潛在的細(xì)胞或組織芯片理想的基底材料[14]。我們以PLLA制備了名義高度為4 μm，名義直徑分別為2 μm和4 μm，名義間距分別為2 μm和7 μm的4種微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以PLLA制備的陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)清晰、規(guī)整，微結(jié)構(gòu)幾何尺寸符合設(shè)計(jì)預(yù)期要求。與PDMS微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底類似[12]，PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在掃描電子顯微制樣后也出現(xiàn)小結(jié)構(gòu) (2 μm微柱)的斷裂或破壞，但在培養(yǎng)條件下微結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并保持完整的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)陣列。這表明紫外光光刻及復(fù)制模塑是制備PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底的有效手段。

我們實(shí)現(xiàn)了SH-SY5Y細(xì)胞在PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上的復(fù)合和培養(yǎng)，提示該基底可作為理想的細(xì)胞或組織芯片培養(yǎng)基底。從結(jié)構(gòu)縱橫比上看，制備的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底其名義縱橫比已經(jīng)達(dá)到1和2，可以被認(rèn)為類似三維微結(jié)構(gòu)基底。然而，由于細(xì)胞大小與微結(jié)構(gòu)尺寸的差異，在這些基底上通常不一定能形成經(jīng)典的三維細(xì)胞生長(zhǎng)。從這一意義出發(fā)，研究拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)與功能特點(diǎn)，并考察其與二維平面基底以及大結(jié)構(gòu)和高縱橫比三維圖式上細(xì)胞生長(zhǎng)行為的相關(guān)性具有重要的意義。

我們以掃描電子顯微鏡的方法對(duì) SH-SY5Y細(xì)胞在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上培養(yǎng)生長(zhǎng)的形態(tài)及鋪展進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在4 種PLLA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底和1種PLLA二維平面基底中，2-2 μm和4-2 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞與PLLA平面基底上細(xì)胞形態(tài)相似，而2-7 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞表現(xiàn)出高的極化和形態(tài)分化趨勢(shì)以及與之相應(yīng)的最小細(xì)胞圓度值，4-7 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞形態(tài)卻更趨向于圓形并具有最大的細(xì)胞圓度值。這一結(jié)果提示拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底的微結(jié)構(gòu)尺寸是影響細(xì)胞形態(tài)及分化的重要因素。對(duì)PLLA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞鋪展面積的定量分析發(fā)現(xiàn)，與平面二維基底上的細(xì)胞相比較，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上的細(xì)胞鋪展程度明顯降低或趨于降低。這一細(xì)胞形態(tài)學(xué)測(cè)量結(jié)果與細(xì)胞骨架的免疫熒光染色結(jié)果一致。較大程度鋪展的SH-SY5Y細(xì)胞具有清晰的肌動(dòng)蛋白微絲結(jié)構(gòu)，尤其是平面基底上的細(xì)胞。而2-2 μm和4-7 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞由于鋪展程度低沒有明顯的肌動(dòng)蛋白微絲。前期以Cytodex微球致密陣列三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底[20]和PLLA三維微小凹圖式[14]的研究發(fā)現(xiàn)，SH-SY5Y細(xì)胞在細(xì)胞三維培養(yǎng)的微小凹圖式或拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上呈明顯的三維分布或聚集生長(zhǎng)。與此同時(shí)細(xì)胞鋪展程度明顯降低。結(jié)合本文對(duì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞形態(tài)及鋪展的研究結(jié)果，我們認(rèn)為在現(xiàn)有PLLA微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上SH-SY5Y細(xì)胞的鋪展程度明顯不同于二維平面基底上培養(yǎng)的細(xì)胞，與前期三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上三維生長(zhǎng)細(xì)胞具有類似的生長(zhǎng)與鋪展特征。與經(jīng)典的二維培養(yǎng)體系相比，在三維培養(yǎng)體系中細(xì)胞通常表現(xiàn)出更圓的細(xì)胞形態(tài)和更低的鋪展程度，這種形態(tài)學(xué)的改變是進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞三維功能表型的基礎(chǔ)[21]。

對(duì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上細(xì)胞VEGF和IL-8的分泌量進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，SH-SY5Y細(xì)胞在所制備的4種PLLA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上的VEGF和/或IL-8分泌量較之PLLA平面結(jié)構(gòu)上明顯增高或趨于增高，其中在2-7 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上VEGF和IL-8的分泌量同時(shí)出現(xiàn)明顯的增高。對(duì) mRNA表達(dá)水平進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SH-SY5Y細(xì)胞在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上VEGF和IL-8的mRNA表達(dá)量亦不同程度地高于平面結(jié)構(gòu)上細(xì)胞的表達(dá)量，其中在2-7 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上VEGF和IL-8的 mRNA表達(dá)量較之平面結(jié)構(gòu)上均出現(xiàn)大幅度的上調(diào) (分別上升20.5倍和12.64倍)。上述VEGF和IL-8的分泌和表達(dá)的增高均伴有細(xì)胞鋪展程度的明顯降低。在三維微小凹圖式條件下，可以發(fā)現(xiàn)微小凹內(nèi)分布的三維細(xì)胞及近似二維(或邊界二維)細(xì)胞的鋪展程度小于平面基底上二維細(xì)胞的相應(yīng)值[13-14]。與此同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)微小凹內(nèi)SH-SY5Y細(xì)胞的VEGF和IL-8分泌量較之平面結(jié)構(gòu)上二維細(xì)胞的相應(yīng)值出現(xiàn)明顯上調(diào)(待發(fā)表資料)。上述結(jié)果提示，SH-SY5Y細(xì)胞在微柱陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上與在三維微小凹條件下具有類似的VEGF和IL-8分泌和表達(dá)行為。

SH-SY5Y細(xì)胞在 PLLA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上VEGF和IL-8表達(dá)和分泌量較之平面結(jié)構(gòu)的相應(yīng)值出現(xiàn)上調(diào)，且這一表達(dá)和分泌量的上調(diào)伴隨細(xì)胞鋪展面積的明顯降低，這一結(jié)果提示VEGF和IL-8有可能作為SH-SY5Y細(xì)胞在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上特定生長(zhǎng)狀態(tài)的分泌物標(biāo)志。值得注意的是，本研究中細(xì)胞在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底和平面結(jié)構(gòu)具有類似的接種和生長(zhǎng)密度 (表3和表4)，這表明細(xì)胞的形態(tài)及分化行為可能是影響 VEGF和 IL-8表達(dá)和分泌量的重要因素。SH-SY5Y細(xì)胞在2-7 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上除鋪展程度降低外，還表現(xiàn)出高的極化程度、最小的細(xì)胞圓度值及部分微絲形成等形態(tài)分化的特征。與此同時(shí)，在該拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上VEGF和IL-8二者的分泌和表達(dá)均同時(shí)出現(xiàn)明顯或大幅度的升高。這一現(xiàn)象提示，SH-SY5Y細(xì)胞在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上 VEGF、IL-8表達(dá)和分泌的增高不僅取決于細(xì)胞的形態(tài)鋪展降低，可能也與細(xì)胞的分化狀態(tài)有明顯的相關(guān)關(guān)系。另一方面，盡管現(xiàn)有的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底引起SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)鋪展降低以及VEGF和IL-8分泌和表達(dá)的上調(diào)，采用一種能引起細(xì)胞鋪展程度增加的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)并考察神經(jīng)細(xì)胞功能分化以及相應(yīng)VEGF和IL-8的分泌和表達(dá)可能具有不同的應(yīng)用前景。有關(guān)這一問題值得進(jìn)一步研究。

拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底是工程化構(gòu)建細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的形態(tài)和功能分化的重要工具。使用拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)一個(gè)最明顯的早期現(xiàn)象是細(xì)胞形態(tài)和鋪展的改變。而細(xì)胞鋪展程度的改變則伴隨著核內(nèi)相關(guān)事件，在調(diào)節(jié)下游功能分化相關(guān)的信號(hào)分子的表達(dá)中有著重要的作用[22-24]。對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞，三維及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在影響細(xì)胞的形態(tài)鋪展及分化的同時(shí)也是調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞離子通道，如VGCCs[13-14,20,25]功能響應(yīng)性的有效手段。

建立神經(jīng)細(xì)胞在三維及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)培養(yǎng)條件下的分泌物標(biāo)志的意義是，分泌物標(biāo)志提供了細(xì)胞在三維或拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上特定生長(zhǎng)狀態(tài)的簡(jiǎn)易、快速而實(shí)用的評(píng)價(jià)手段。不僅如此，有關(guān)分泌物標(biāo)志的確立也將為神經(jīng)細(xì)胞在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和三維微結(jié)構(gòu)條件下離子通道功能響應(yīng)性的研究提供重要的參考。對(duì)于VEGF和 IL-8，已有的研究表明在三維條件下該二因子的分泌和表達(dá)也出現(xiàn)明顯上調(diào)[15,17,26]，且 VEGF和 IL-8是影響的神經(jīng)細(xì)胞功能分化的調(diào)節(jié)因子[27-28]。近年的研究更進(jìn)一步表明，VEGF和IL-8是調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞VGCCs門控特性或功能響應(yīng)性的重要細(xì)胞因子[16,28]。使用外源性VEGF、IL-8分別作用于二維條件下SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，在特定的濃度范圍內(nèi) VEGF (2～200 ng/mL)和 IL-8(0.0005-1 nmol/L)可以引起細(xì)胞VGCCs功能響應(yīng)性明顯降低。這一發(fā)現(xiàn)提示，VEGF和 IL-8有可能是引起三維及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)條件下神經(jīng)細(xì)胞VGCCs功能響應(yīng)性改變的值得關(guān)注的機(jī)制之一。

4 結(jié)論

本文成功制備了微柱名義直徑為 2 μm 和4 μm、微柱名義間距為 2 μm和 7 μm的 4種陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底，并實(shí)現(xiàn)了SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞與PLLA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底的復(fù)合。研究發(fā)現(xiàn)，SH-SY5Y 細(xì)胞在 2-2 μm、4-2 μm、4-7 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上的VEGF或IL-8表達(dá)和分泌量相比平面結(jié)構(gòu)的相應(yīng)值出現(xiàn)上調(diào)，而在 2-7 μm拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上VEGF及IL-8二者同時(shí)表現(xiàn)出表達(dá)和分泌量的上調(diào)。與在PLLA平面基底上相比，SH-SY5Y細(xì)胞在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上表現(xiàn)出細(xì)胞形態(tài) (鋪展面積、圓度及肌動(dòng)蛋白微絲)的明顯變化，細(xì)胞VEGF及IL-8表達(dá)和分泌量的上調(diào)伴隨細(xì)胞鋪展面積的明顯降低。上述結(jié)果表明陣列型微柱拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是影響 SH-SY5Y細(xì)胞VEGF、IL-8表達(dá)的重要微環(huán)境因素，VEGF和IL-8可能構(gòu)成SH-SY5Y細(xì)胞在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基底上生長(zhǎng)的重要分泌物標(biāo)志。

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