高同型半胱氨酸對(duì)小鼠足細(xì)胞CD2AP表達(dá)的影響

張曉亮 柳 潔* 馬春明 張姬欣 高 穎

（山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030012）

高同型半胱氨酸對(duì)小鼠足細(xì)胞CD2AP表達(dá)的影響

張曉亮 柳 潔* 馬春明 張姬欣 高 穎

（山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030012）

目的 觀察α-硫辛酸對(duì)高同型半胱氨酸（Hcy）作用下小鼠足細(xì)胞胞CD2AP mRNA表達(dá)的影響，探討α-硫辛酸對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用。方法 將體外培養(yǎng)的足細(xì)胞分為正常組、Hcy組、Hcy+α-硫辛酸組，培養(yǎng)24、48、72h時(shí)分別收集細(xì)胞，RT-PCR法檢測(cè)CD2AP mRNA表達(dá)。結(jié)果 Hcy組，足細(xì)胞CD2AP mRNA表達(dá)自24h開始下調(diào)（P＜0.05），且有一定的時(shí)效性，72h達(dá)到下調(diào)高峰（P＜0.01）；Hcy+α-硫辛酸組，48h時(shí)，CD2AP mRNA表達(dá)較Hcy組增高（P＜0.05），72h仍有上述差異（P＜0.05）。結(jié)論 α-硫辛酸對(duì)足細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，可能與其可對(duì)抗高同型半胱氨酸下CD2AP mRNA表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

同型半胱氨酸；足細(xì)胞；α-硫辛酸；Nephrin

近年來，同型半胱氨酸（Hcy）作為一種血管反應(yīng)性氨基酸，其在糖尿病微血管并發(fā)癥中的作用越來越受到大家的關(guān)注，隨著對(duì)足細(xì)胞的研究和認(rèn)識(shí)逐漸深入，足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白表達(dá)異常在糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）發(fā)病中的重要作用被逐漸認(rèn)同，CD2AP作為裂隙孔膜蛋白的重要組成，其表達(dá)異常可導(dǎo)致足細(xì)胞裂孔隔膜的完整性被破壞，濾過屏障功能受損，直接影響DN的發(fā)生發(fā)展。本研究通過觀察α-硫辛酸對(duì)高Hcy環(huán)境下足細(xì)胞CD2AP mRNA表達(dá)的影響，探討α-硫辛酸對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

小鼠足細(xì)胞（復(fù)旦大學(xué)細(xì)胞中心）；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司）；無支原體胎牛血清FBS（杭州四季青生物有限公司）；含EDTA胰酶（美國(guó)Hyclone公司）；青鏈霉素（北京Solarbio公司）；小鼠γ-干擾素（美國(guó)Peprotech公司）；Hcy和α-硫辛酸（美國(guó)Sigma公司）；RT-PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。超凈工作臺(tái)（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；HF90/HF24二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司），7300 Real Time PCR System、PCR System 9700（美國(guó)ABI公司）；FC500流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng) 足細(xì)胞培養(yǎng)方法參考 Mundel等[1]，細(xì)胞于含50 U/mLγ-干擾素，100U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，在33℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入不含γ-干擾素的10%胎牛血清1640培養(yǎng)液，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)分化10～14 d后使用。分化成熟的細(xì)胞于不含胎牛血清的1640培養(yǎng)液中同步培養(yǎng)24h，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆纸M：正常組（等體積1640培養(yǎng)基）、高Hcy組（1mmol/L的Hcy）、混合組（1mmol/L的Hcy+0.5mmol/Lα-硫辛酸）。

1.3 Nephrin mRNA表達(dá)測(cè)定

按上述方法培養(yǎng)的細(xì)胞，分別于培養(yǎng)24、48、72h收集細(xì)胞，抽提細(xì)胞總RNA以RT-PCR半定量方法測(cè)定podocin mRNA表達(dá), 引物序列見表 1。反應(yīng)結(jié)束后，RT-PCR相對(duì)定量結(jié)果采用2- △△ CT法：ΔCt=Ct目的基因-Ct管家基因，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。所有操作均按試劑盒說明書進(jìn)行。見表1。

表1 RT-PCR測(cè)定引物RT-PCR testprimer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔，所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

各組CD2AP mRNA表達(dá)如表1所示，與對(duì)照組相比，Hcy組及混合組CD2AP mRNA表達(dá)自24h開始呈下調(diào)趨勢(shì)（P＜0.05），72h尤其明顯（P＜0.01）；48h時(shí)混合組CD2AP mRNA較Hcy組表達(dá)增多（P＜0.05），72h仍有上述差異，說明α-硫辛酸可對(duì)抗高Hcy對(duì)CD2AP mRNA表達(dá)的下調(diào)作用。見表2。

表2 各組Nephrin mRNA表達(dá)變化（%，，n=6）

表2 各組Nephrin mRNA表達(dá)變化（%，，n=6）

注：以正常葡萄糖組作為對(duì)照組，其他各組分別作為實(shí)驗(yàn)組，由于計(jì)算而得的相對(duì)倍數(shù)均＜1，將結(jié)果以百分?jǐn)?shù)形式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以正常對(duì)照組作為100，其余各組分別與對(duì)照組進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，與正常對(duì)照組相比，*表示P＜0.05；與同組24h相比，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；與同組48h相比，▲表示P＜0.05：與高Hcy組相比，#表示P＜0.05

組別時(shí)間24h48h72h高Hcy組46.83±3.26*28.07±0.93*△16.44±1.44*▲混合組41.06±4.11*36.79±1.89*△#25.36±1.57*▲△△#

3 討 論

Hcy是一種反應(yīng)性血管損傷氨基酸，近年來研究表明，Hcy不僅是心、腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其與糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展也存在一定的關(guān)聯(lián)。有文獻(xiàn)報(bào)道[2]，高Hcy血癥是DN 的危險(xiǎn)因素。高Hcy 可通過促進(jìn)活性氧過多產(chǎn)生致氧化應(yīng)激激活多元醇、晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）、PKC、己糖途徑導(dǎo)致腎臟損傷，加速DN的進(jìn)程[3]。本研究顯示，高Hcy可下調(diào)足細(xì)胞CD2AP mRNA表達(dá)，且有一定的時(shí)效性，與上述報(bào)道一致。硫辛酸是一種強(qiáng)效的抗氧化劑，可清除包括氫氧自由基、單態(tài)氧、一氧化氮自由基、氫過氧化物等在內(nèi)的多種氧化應(yīng)激產(chǎn)物，維持機(jī)體正常的抗氧化水平。有研究發(fā)現(xiàn)[4]α-硫辛酸可抑制氧化應(yīng)激所引起的核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號(hào)通路的激活，從而減輕系膜細(xì)胞的增殖。α-硫辛酸能降低DN患者血漿中Hcy的水平，改善血管內(nèi)皮功能，從而延緩糖尿病腎病的進(jìn)展[5]。本研究還顯示，48h時(shí)，混合組CD2AP mRNA表達(dá)較高同型半胱氨酸組增高，72h時(shí)仍有此差異，因此推測(cè)α-硫辛酸可對(duì)抗高Hcy對(duì)CD2AP mRNA的下調(diào)作用，可能與其抗氧化應(yīng)激有關(guān)。

綜上所述，高Hcy可下調(diào)足細(xì)胞CD2AP mRNA表達(dá)，α-硫辛酸可對(duì)抗此下調(diào)作用，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

[1] Mundel P,Reiser J,Zú?iga Mejía Borja A, et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines [J]. Exp Cell Res,1997,236(1):248-258.

[2] 李計(jì)元.同型半胱氨酸與血管疾病[J].醫(yī)學(xué)綜述,2008,14(5):712-714.

[3] 魏劍芬,程燕.糖尿病腎病患者血清同型半胱氨酸與氧化應(yīng)激的關(guān)系[J].天津醫(yī)藥,2008,38(10):871-873.

[4] 李慧,賈一韜,韋多,等.α-硫辛酸對(duì)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞核因子-κB活性的抑制作用[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2006,31(11):1074-1076.

[5] 孫麗,陳亙卓,劉麗,等.α-硫辛酸對(duì)2型糖尿病腎病患者高同型半胱氨酸血癥及血管內(nèi)皮功能的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥指南,2011,9(27):223-224.

Effects of Alpha-lipoic Acid on the Expression of CD2AP in Mouse Podocytes Cultured in Homocysteine Environment

ZHANG Xiao-liang, LIU Jie, MA Chun-ming, ZHANG Ji-xin, GAO Yi
(Shanxi Medical University, Taiyuan 030012, China)

Objective To observation the effect of the alpha-lipoic acid on the expression of CD2AP mRNA in mouse podocytes cultured in homocysteine environment,To explore the protective effects of alpha-lipoic acid on podocyte. Methods The podocytes were cultured in high homocysteine and alphalipoic acid environment and collected respectively at 24、48、72h, the mRNA expression of CD2AP was examined by RT-PCR. Result The expression of CD2AP mRNA was decreased, and there is a certain timelines, alpha lipoic acid can resist the trend. Conclusion Alpha lipoic acid has protective effect on podocytes, and it can resist down-regulating the expression of CD2AP mRNA.

Alpha lipoic acid; Homocysteine; Podocyte; CD2AP

R54

B

1671-8194（2013）19-0069-02

*通訊作者：E-mail： liujie6@medmail.com.cn