緩激肽多肽片段間非共價(jià)作用的質(zhì)譜研究

陳 琛 儲艷秋 戴新華 方 向 丁傳凡,*

(1復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系激光化學(xué)研究所,上海200433;2中國計(jì)量科學(xué)研究院化學(xué)計(jì)量與分析科學(xué)研究所,北京100013)

1 引言

蛋白質(zhì)分子是一切生命的基礎(chǔ),1它的結(jié)構(gòu)和功能一直是生命科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)人們關(guān)注的主要問題之一.2目前大多數(shù)的理論認(rèn)為,影響溶液中蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的因素有多種,包括疏水作用、氫鍵作用、二硫鍵的形成等.3-5雖然經(jīng)過數(shù)十年來科學(xué)家們的不斷努力,已經(jīng)取得了較大成就和進(jìn)展,但由于多肽和蛋白質(zhì)分子的分子內(nèi)作用力的復(fù)雜性,多肽和蛋白質(zhì)分子的氣相構(gòu)象等問題仍然需要作進(jìn)一步深入的探討.6-8

近幾年以來,隨著質(zhì)譜學(xué)技術(shù)在生命科學(xué)中的廣泛應(yīng)用,有關(guān)氣相多肽和蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的研究取得了很多進(jìn)展.隨著軟電離技術(shù)的發(fā)展,特別是電噴霧電離(ESI)9,10和基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)11,12等技術(shù)的出現(xiàn),多肽和蛋白質(zhì)樣品在分析過程中,可以“完整”地由溶液進(jìn)入氣相而被檢測,接近生理狀態(tài)下獲得分子相互作用的化學(xué)計(jì)量比、結(jié)合勢和能量等信息.13這種“軟”電離技術(shù)不但使得一些熱不穩(wěn)定、強(qiáng)極性、難揮發(fā)的化合物可以被檢測,而且使得質(zhì)譜的應(yīng)用范圍從小分子擴(kuò)展到蛋白質(zhì)等生物大分子.因此,電噴霧質(zhì)譜已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)以及多肽之間非共價(jià)相互作用的有效手段之一.14

質(zhì)譜學(xué)探討氣相多肽分子的結(jié)構(gòu)15具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):第一,可以將感興趣的某一種多肽分子單獨(dú)“挑”出來開展研究,因此可以獲得與這種多肽分子一一對應(yīng)的化學(xué)或物理性質(zhì)信息,而不是眾多分子的平均信息;第二,由于可以獲得去溶劑化情況下多肽分子的結(jié)構(gòu),因此可以排除溶劑化作用的影響,所得到的多肽主要考慮分子間氫鍵和疏水力的作用;第三,串級質(zhì)譜分析技術(shù)還可以定量或半定量地獲得多肽分子間或分子內(nèi)相互作用鍵合強(qiáng)度的信息.例如,Koomen等16采用電噴霧質(zhì)譜法等技術(shù)研究了強(qiáng)啡肽1-7和胃泌激素I這兩種多肽間的非共價(jià)相互作用.結(jié)果發(fā)現(xiàn),在pH 5-7的時候,強(qiáng)啡肽1-7和胃泌激素I可以形成非共價(jià)復(fù)合物,而且單個多肽不會形成二聚體.

緩激肽分子是由九個氨基酸縮合而成的多肽.緩激肽對于人體而言具有多種功能.17-21例如,緩激肽可以作為一種血漿激肽調(diào)節(jié)肌肉的收縮和舒張,調(diào)節(jié)毛細(xì)血管的滲透性,作為合成一氧化氮的選擇性前體,可以參與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑對心血管起保護(hù)作用,對小細(xì)胞肺癌起抑制作用等.因此,三維結(jié)構(gòu)的氣相緩激肽的空間構(gòu)象引起了人們極大的興趣.許多方法被應(yīng)用于研究緩激肽的結(jié)構(gòu).例如,Lopez等22用固體核磁共振(NMR)的方法研究了與人體G-蛋白偶聯(lián)受體B2結(jié)合的緩激肽的結(jié)構(gòu).Wyttenbach等23用離子色譜的方法研究了緩激肽分子的氣相構(gòu)象,得到了它們精確的碰撞截面.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),由基質(zhì)輔助激光解吸電離得到的三種陽離子形式的緩激肽離子(BK+H)+、(BK+Na)+、(BK-H+2Na)+具有幾乎相同的碰撞截面(2.45±0.03)nm2.并且這些碰撞截面在300到600 K的溫度下是相互獨(dú)立的.

值得一提的有Rodriquez等24通過量子化學(xué)理論計(jì)算,預(yù)計(jì)氣相緩激肽(序列為RPPGFSPFR)在空間可以形成穩(wěn)定的構(gòu)象.對于+1價(jià)緩激肽[BK+H]+而言,C端精氨酸殘基的羧基和N端精氨酸側(cè)鏈的胍基上的氮原子形成的氫鍵是緩激肽構(gòu)象穩(wěn)定的主要因素,也就是說,與溶液中相同,+1價(jià)緩激肽[BK+H]+在氣相仍然可以形成兩性離子(zwitterion).可以預(yù)見,緩激肽兩端的精氨酸殘基(R)對于其在氣相中的穩(wěn)定性起著至關(guān)重要的作用.

本文選用緩激肽分子(圖1)為研究對象,研究分子內(nèi)氫鍵對多肽空間結(jié)構(gòu)的影響.Russell等25在對氣相緩激肽離子構(gòu)象的研究中發(fā)現(xiàn),緩激肽分子中在絲氨酸與脯氨酸之間(圖1中位置1),以及苯丙氨酸與絲氨酸之間(圖1中位置2)易發(fā)生斷裂.由此,我們想探討分子的折疊是否由于其兩邊的多肽之間的非共價(jià)作用——?dú)滏I相互作用造成的,因此分別在斷裂位置1合成對應(yīng)的兩種多肽RPPGFS和PFR,在斷裂位置2合成多肽RPPGF和SPFR.此外,由于Rodriquez等24預(yù)計(jì)緩激肽兩端的精氨酸殘基(R)可以形成氫鍵,因此,我們又設(shè)計(jì)合成了去掉N端或者C端精氨酸的多肽PPGFS、PPGF、PF和SPF.采用電噴霧質(zhì)譜研究了緩激肽兩種斷裂方式產(chǎn)生的多肽,以及緩激肽兩端去掉精氨酸殘基(R)后兩種斷裂方式產(chǎn)生多肽之間的非共價(jià)相互作用.通過對非共價(jià)復(fù)合物離子[A+B+H]+(A,B表示不同的多肽)的碰撞誘導(dǎo)解離,定性地比較了不同多肽間氫鍵的結(jié)合強(qiáng)度,并使用質(zhì)譜滴定法定量地比較了緩激肽兩端是否含有精氨酸對其構(gòu)象穩(wěn)定性的影響.

圖1 緩激肽分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of bradykinin

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 化學(xué)試劑

實(shí)驗(yàn)中所用的多肽樣品RS-6(RPPGFS)、PR-3(PFR)、RF-5(RPPGF)、SR-4(SPFR)、PS-5(PPGFS)、PF-4(PPGF)、PF-2(PF)和SF-3(SPF)購于吉爾生化上海有限公司,中國,其序列及各項(xiàng)參數(shù)如表1所示.甲醇(純度99.9%)購于Merck化學(xué)試劑公司,德國(Darmstadt,Germany),乙酸(純度99.5%)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司,中國.

2.2 多肽溶液的制備

將8種多肽樣品溶于去離子水中,用含有0.1%醋酸的甲醇溶液(甲醇與水體積比為9:1)稀釋成8×10-5mol·L-1的溶液.任選兩種多肽樣品配制得到摩爾比為1:1的多肽混合液,其中單個多肽的濃度為2×10-5mol·L-1.將得到的28組多肽混合液在25 °C的恒溫箱內(nèi)反應(yīng)24 h.另配制單個多肽濃度為2×10-5mol·L-1的8種多肽混合液,在25°C的恒溫箱內(nèi)反應(yīng)24 h待用.

表1 多肽樣品序列及其它參數(shù)Table 1 Sequence and other parameters of peptide samples

2.3 電噴霧電離質(zhì)譜的測定

Finnigan LTQ線性離子阱質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan,美國,m/z2000),電噴霧電離離子源(ESI),正離子掃描模式.采用流動進(jìn)樣分析(FIA),進(jìn)樣速率為5 μL·min-1.所用的助噴霧氣和簾氣均為高純氮?dú)?99.999%).電噴霧電離工作電壓為3.5 kV,毛細(xì)管溫度設(shè)為350°C.

2.4 碰撞誘導(dǎo)解離實(shí)驗(yàn)

為了探討多肽與多肽相互作用形成的非共價(jià)復(fù)合物的結(jié)合強(qiáng)度,我們在不同的碰撞能量下對其進(jìn)行了碰撞誘導(dǎo)解離(CID)的實(shí)驗(yàn).碰撞誘導(dǎo)解離實(shí)驗(yàn)的測定與2.3節(jié)中所用儀器相同,氦氣作為碰撞氣體,離子活化參數(shù)Q值設(shè)為0.25,活化時間為30 ms,隔離寬度設(shè)為1m/z.

2.5 結(jié)合常數(shù)的測定

配制不同摩爾比(1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10)的多肽RS-6和多肽PR-3的混合液、多肽RF-5和多肽SR-4的混合液以及多肽PF-4和多肽SF-3的混合液,經(jīng)過ESI-MS分析,由公式(1),26計(jì)算得到兩個多肽之間的結(jié)合常數(shù)Kst.定義Kst=[A+B+H]+/([A][B]),定義Ir=Ic/(Ic+Ia),Ir代表質(zhì)譜峰的相對強(qiáng)度,其中Ic和Ia分別表示非共價(jià)復(fù)合物[A+B+H]+和多肽A質(zhì)譜峰的相對強(qiáng)度.Kc是常數(shù),[A]、[B]表示兩個多肽的初始濃度.

3 結(jié)果與討論

3.1 電噴霧質(zhì)譜結(jié)果

將合成得到的8種多肽混合溶液進(jìn)樣,ESI-MS結(jié)果顯示,除去單個多肽的質(zhì)譜峰外,存在兩個多肽間的非共價(jià)結(jié)合峰,包括[PS-5+PF-4+H]+、[RF-5+PF-4+H]+、[2RF-5+H]+、[RS-6+RF-5+H]+以及具有相同m/z=1076.17的質(zhì)譜峰[RS-6+PF-4+H]+和[RF-5+PS-5+H]+,如圖2所示.可以發(fā)現(xiàn)這些非共價(jià)結(jié)合峰對應(yīng)的兩個多肽具有相似的序列,其中一個多肽完全包含另一個多肽的序列,例如多肽PS-5(PPGFS)和PF-4(PPGF),故這類非共價(jià)結(jié)合峰類似單個多肽二聚體的非共價(jià)結(jié)合峰,例如[2RF-5+H]+.而m/z=1078.42的結(jié)合峰對應(yīng)[RS-6+PR-3+H]+和[RF-5+SR-4+H]+,是多肽RS-6和多肽PR-3以及多肽RF-5和多肽SR-4在自由競爭的環(huán)境下,形成較強(qiáng)的非共價(jià)結(jié)合質(zhì)譜峰,而這兩條多肽正好對應(yīng)緩激肽分子在位置1和2斷裂形成的碎片多肽.由此可以證明緩激肽二級結(jié)構(gòu)中的分子折疊是由于碎片多肽之間較強(qiáng)的氫鍵作用引起的.

3.1.1 不同斷裂位置下碎片多肽之間的相互作用

在斷裂位置1下合成得到兩種多肽RS-6(RPPGFS)和PR-3(PFR),將其以1:1混合反應(yīng),得到的質(zhì)譜圖如圖3(a)所示.m/z=1078.33所對應(yīng)的分子離子為[RS-6+PR-3+H]+離子,它表明多肽RS-6和多肽PR-3之間存在非共價(jià)相互作用并形成了新的復(fù)合物.在斷裂方式2下得到多肽RF-5(RPPGF)和SR-4(SPFR),同樣以1:1混合反應(yīng),得到的質(zhì)譜圖如圖3(b)所示.其中m/z=1078.42所對應(yīng)的分子離子為[RF-5+SR-4+H]+離子,表明多肽RF-5和多肽SR-4之間也存在非共價(jià)的相互作用,并且形成了非共價(jià)復(fù)合物.可見,在這兩處斷裂位置下對應(yīng)合成的兩條多肽分子都能夠再次結(jié)合,并形成非共價(jià)復(fù)合物,它說明緩激肽分子中這兩條片段之間存在氫鍵作用.

圖2 8個混合肽的電噴霧電離質(zhì)譜圖Fig.2 ESI mass spectra of 8 mixed peptides

圖3 多肽組合(a)RS-6+PR-3,(b)RF-5+SR-4的電噴霧電離質(zhì)譜圖Fig.3 ESI mass spectra of peptide mixtures(a)RS-6+PR-3,(b)RF-5+SR-4

3.1.2 去掉N端或C端精氨酸后合成的多肽間的相互作用

將緩激肽分子N端的精氨酸(R)去掉后,在斷裂位置1下合成得到PS-5(PPGFS)和PR-3(PFR)兩種多肽,在相同的條件下以1:1混合反應(yīng),得到圖4(a)所示的質(zhì)譜圖.其中m/z=922.17所對應(yīng)的分子離子峰為[PS-5+PR-3+H]+離子.在斷裂位置2下合成得到對應(yīng)序列的多肽PF-4(PPGF)和SR-4(SPFR),同樣條件下反應(yīng),得到圖4(b)的電噴霧質(zhì)譜結(jié)果,其中m/z=922.17是形成的非共價(jià)結(jié)合峰[PF-4+SR-4+H]+.

當(dāng)將緩激肽分子C端的精氨酸(R)去掉后,斷裂位置1下合成得到RS-6(RPPGFS)和PF-2(PF)兩種多肽,將其以1:1混合反應(yīng),發(fā)現(xiàn)沒有結(jié)合峰的質(zhì)譜信號出現(xiàn).將同時去掉緩激肽分子中N端和C端精氨酸后合成得到的多肽PS-5(PPGFS)和PF-2(PF)以1:1混合反應(yīng)后,也未得到兩者的結(jié)合信號.然而在斷裂方式2下,去掉C端精氨酸后合成得到多肽RF-5(RPPGF)和SF-3(SPF);同時去掉N端和C端的精氨酸合成得到多肽PF-4(PPGF)和SF-3(SPF)都能夠形成1:1的非共價(jià)復(fù)合物,所得到的質(zhì)譜圖如圖4(c,d)所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,緩激肽分子中N端的精氨酸對于兩個多肽間相互作用的影響較小,而C端的精氨酸對其相互作用則影響較大.

圖4 多肽組合(a)PS-5+PR-3,(b)PF-4+SR-4,(c)RF-5+SF-3,(d)PF-4+SF-3的電噴霧電離質(zhì)譜圖Fig.4 ESI mass spectra of peptide mixtures(a)PS-5+PR-3,(b)PF-4+SR-4,(c)RF-5+SF-3,(d)PF-4+SF-3

通過以上實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn),在斷裂位置2下,無論去掉N端或者C端的精氨酸,或者同時去掉N端和C端的精氨酸得到的兩個多肽之間都是可以形成非共價(jià)結(jié)合的,如圖4中(b,c,d)所示.說明在這種斷裂方式下,由于一條多肽的N端為絲氨酸,它不僅存在一個氨基并且絲氨酸的側(cè)鏈上含有羥基基團(tuán),從而容易與其他多肽之間形成氫鍵.

Wyttenbach等23的研究表明緩激肽在空間呈現(xiàn)緊密的球形結(jié)構(gòu)(global).在緩激肽的優(yōu)勢構(gòu)象中,在多肽序列Ser6-Pro7-Phe8-Arg9位置處有一個β-轉(zhuǎn)角.而Russell等25在對氣相緩激肽離子構(gòu)象的研究中發(fā)現(xiàn),緩激肽分子中苯丙氨酸與絲氨酸之間(圖1中位置2)易發(fā)生斷裂.因此,絲氨酸位置的β-轉(zhuǎn)角可能是位置2易發(fā)生斷裂的原因.而位置1中連接的是絲氨酸與脯氨酸,眾所周知,脯氨酸的連接位點(diǎn)為容易發(fā)生斷裂的位置.有趣的是,我們的研究發(fā)現(xiàn),即使沒有端位的精氨酸,帶有絲氨酸的SPF仍然可以與PPGF結(jié)合,表明絲氨酸在緩激肽優(yōu)勢構(gòu)象的β-轉(zhuǎn)角中發(fā)揮重要的作用,即對于緩激肽二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起到了重要的作用.

3.1.3 任意兩種多肽間的非共價(jià)結(jié)合情況

將8種多肽中任意兩種以1:1摩爾比混合反應(yīng)得到28組混合肽,其結(jié)合情況結(jié)果如表2所示.通過電噴霧質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn),多肽PF-2(PF)與其他大多數(shù)多肽無相互作用,這是由于多肽PF-2是由兩個疏水的氨基酸脯氨酸(P)和苯丙氨酸(F)組成.其中脯氨酸是一種亞氨基酸,它的α氨基和側(cè)鏈形成五元環(huán)的結(jié)構(gòu),而苯丙氨酸的側(cè)鏈上含有一個苯環(huán),這些結(jié)構(gòu)都使得它們不容易與其他的多肽通過氫鍵等作用力發(fā)生相互作用.

表2 任意兩個多肽混合后的非共價(jià)結(jié)合情況Table 2 Combination results of the mixture of two peptides

3.2 碰撞誘導(dǎo)解離實(shí)驗(yàn)

對上述28組混合肽中有相互作用組合的結(jié)合峰在不同的碰撞能量下進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離的實(shí)驗(yàn).選取結(jié)合峰作為母離子,碰撞能量從10 eV開始增加,以氦氣作為碰撞氣體進(jìn)行反應(yīng),如圖5所示.表3顯示的是開始出現(xiàn)對應(yīng)的多肽碎片離子時的能量,以及母離子峰強(qiáng)度降低到最強(qiáng)碎片峰強(qiáng)度10%時的碰撞能量.由CID的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,多肽組合RS-6+PR-3,RF-5+SR-4(分別對應(yīng)與緩激肽分子在位置1、2斷裂得到的碎片序列相同的多肽)其結(jié)合峰降低到最強(qiáng)峰強(qiáng)度的10%時所需要的能量較大,為50 eV,說明這兩種多肽之間的非共價(jià)相互作用較強(qiáng).而去掉N端精氨酸的多肽組合PS-5+PR-3和PF-4+SR-4中的兩個多肽間的相互作用也較強(qiáng),同樣為50 eV,進(jìn)一步說明了N端精氨酸對兩條肽段之間的相互作用影響較小.而同時去掉N端和C端精氨酸的多肽組合PF-4+SF-3,他們之間的相互作用力相對較小,在25 eV的碰撞能量下,其結(jié)合峰的強(qiáng)度就降低到最強(qiáng)峰強(qiáng)度的10%以下.可見C端的精氨酸對于兩條多肽鏈之間的相互作用有重要的影響.這也為解釋緩激肽分子空間結(jié)構(gòu)的形成提供了重要、可靠的基礎(chǔ)信息.

3.3 結(jié)合常數(shù)的測定

Rodriquez等24通過量子化學(xué)理論計(jì)算,指出在+1價(jià)氣相緩激肽中,C端精氨酸殘基的羧基和N端精氨酸側(cè)鏈的胍基上的氮原子可以形成氫鍵,+1價(jià)緩激肽[BK+H]+在氣相仍然為兩性離.Schnier等27通過黑體輻射實(shí)驗(yàn)也提供證據(jù)證明緩激肽在氣相中含有一個鹽橋的結(jié)構(gòu).為了定量比較N端或C端是否帶有精氨酸對氣相緩激肽分子的影響,我們測定了多肽RS-6和PR-3、多肽RF-5和SR-4以及多肽PF-4和SF-3兩兩之間的結(jié)合常數(shù).

實(shí)驗(yàn)中,固定多肽RS-6的濃度為1×10-5mol·L-1,配制摩爾比為1:1、1:2至1:10的多肽RS-6與PR-3的混合液,其余兩組溶液配制方法相同.經(jīng)過ESI-MS分析,通過公式(1)可知,1/Ir和1/[B]之間存在線性關(guān)系,通過作圖,結(jié)合常數(shù)Kst可由截距與斜率的比求得.實(shí)驗(yàn)中測得的三組多肽間的結(jié)合常數(shù)如表4所示.

圖5 [RF-5+SR-4+H]+在不同碰撞能量下的CID結(jié)果Fig.5 CID results of[RF-5+SR-4+H]+at different collision energies

表3 多肽復(fù)合物的CID結(jié)果Table 3 CID results of peptide complexes

表4 三組多肽的結(jié)合常數(shù)及線性擬合方程Table 4 Linear equation and binding constants for three groups of peptides

根據(jù)文獻(xiàn),7反應(yīng)的產(chǎn)率a1可以由公式(2)計(jì)算,其中Icomplex和Ipeptide1分別為復(fù)合物和其中一個多肽片段的質(zhì)譜強(qiáng)度,計(jì)算結(jié)果也列于表4.

產(chǎn)率計(jì)算結(jié)果表明,端位不帶精氨酸的多肽片段之間的反應(yīng)產(chǎn)率(5%)要低于端位帶有精氨酸的多肽RS-6與PR-3(10%)或與RF-5與SR-4(10%)的產(chǎn)率,產(chǎn)率的結(jié)果也表明端位帶有精氨酸的多肽間更容易發(fā)生反應(yīng).

結(jié)合常數(shù)的數(shù)據(jù)表明,多肽RS-6與多肽PR-3(3.53×103),以及多肽RF-5與多肽SR-4(3.16×103)之間的非共價(jià)結(jié)合較強(qiáng),而同時去掉N端和C端精氨酸的合成得到的多肽PF-4與多肽SF-3的結(jié)合(1.25×103)相對較弱.這也與上面碰撞誘導(dǎo)解離的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.進(jìn)一步說明N端和C端精氨酸的氫鍵結(jié)合對于緩激肽分子折疊起著重要的作用.

4 結(jié)論

用電噴霧質(zhì)譜法結(jié)合碰撞誘導(dǎo)解離技術(shù)研究了基于緩激肽分子的碎片多肽片段之間的非共價(jià)相互作用.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在斷裂方式1下,緩激肽多肽片段RS-6和PR-3之間可以形成1:1的非共價(jià)復(fù)合物.去掉緩激肽分子N端精氨酸后的多肽PS-5和PR-3也可以形成1:1的非共價(jià)復(fù)合物.當(dāng)去掉緩激肽分子C端精氨酸后,RS-6和PF-2的反應(yīng)液中沒有結(jié)合的復(fù)合物的質(zhì)譜峰出現(xiàn).同時去掉N端和C端精氨酸后的多肽組合PS-5和FP-2其質(zhì)譜圖中,也沒有結(jié)合的復(fù)合物質(zhì)譜峰.斷裂方式2下,合成得到多肽RF-5和SR-4,去掉緩激肽分子N端或者C端精氨酸后合成得到的多肽組合PF-4+SR-4、RF-5+SF-3、PF-4+SF-3,都能得到1:1的結(jié)合產(chǎn)物.通過碰撞誘導(dǎo)解離技術(shù),確定了多肽與多肽之間形成的1:1非共價(jià)復(fù)合物.在不同的碰撞能量下,定性地分析了不同序列多肽之間相互作用強(qiáng)度的大小,結(jié)果發(fā)現(xiàn)RS-6+PR-3及RF-5+SR-4之間的非共價(jià)氫鍵相互作用比其他多肽間的非共價(jià)作用要強(qiáng),自由競爭狀態(tài)下形成的質(zhì)譜峰也證實(shí)了這一點(diǎn).同時去掉N端和C端精氨酸合成得到的多肽組合PF-4+SF-3的非共價(jià)結(jié)合較弱.質(zhì)譜滴定法定量測得的RS-6和PR-3的結(jié)合常數(shù)為3.53×103,與RF-5+SR-4的結(jié)合常數(shù)(3.16×103)相接近,它們均大于去除精氨酸的PF-4+SF-3的結(jié)合常數(shù)(1.25×103).

綜合質(zhì)譜譜圖分析、碰撞誘導(dǎo)解離以及質(zhì)譜滴定的定量測定結(jié)果,可以判定絲氨酸位于氣相緩激肽分子轉(zhuǎn)角位置,而緩激肽分子兩端的精氨酸之間的氫鍵作用對氣相緩激肽分子構(gòu)象的穩(wěn)定起著重要作用.

(1)Aebersold,R.;Goodlett,D.R.Chem.Rev.2001,101,269.doi:10.1021/cr990076h

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