臍帶MSCs對RA患者PBMC中ROR－γt及IL－17表達的影響

許平娟，王 秦，閆 欣

(1上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院，上海201414;2山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院)

美國風濕病學會近年的一項流行病學調(diào)查表明，類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)已成為常見的全身性自身免疫性疾病，慢作用藥物的應用使患者的致殘率近年有所下降，但臨床緩解率僅能達到40% ～57%，且毒副作用較為嚴重［1］。臍帶間充質(zhì)干細胞(MSCs)體內(nèi)移植治療自身免疫性疾病成為近年研究的熱點，動物模型顯示其能明顯改善腎小球腎炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病的癥狀、有效治療和預防移植物抗宿主病(GVHD)［2～5］，其機制可能是通過某種方式導致了T細胞的不反應［6，7］。本研究觀察了臍帶MSCs體外培養(yǎng)對Th17細胞調(diào)節(jié)機制的影響，以期為RA的免疫治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 無菌條件下留取的足月順產(chǎn)新生兒臍帶(由山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，均征得新生兒父母同意)，用PBS反復沖洗，并仔細剔除臍帶內(nèi)血管，只留下華頓膠樣組織。低糖DMEM培養(yǎng)液，Percoll分離液，Phannacia公司胎牛血清，杭州四季青公司Human Th17細胞因子，CBA分析試劑盒(Becton Dickinson公司，USA)，PCR 試劑(Fermentas公司，USA)，上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成PCR引物。我院18例RA患者(RA組)及6例體檢中心健康志愿者(對照組)清晨空腹靜止狀態(tài)抽取的靜脈血15 mL，留存于肝素抗凝管，所有標本于采集后1 h內(nèi)進行相關(guān)實驗。其中RA組男、女各9例，年齡 23～67(38．13±12．15)歲，均符合1987年ACR修訂的RA診斷標準，并除外其他慢性疾患，其中疾病活動指數(shù)(DAS)28＞5．1者6例、3．2＜DAS≤5．1者6例、DAS28≤3．2者6例;對照組男2例、女 4例，年齡24～56(46．13±11．25)歲。兩組一般資料具有可比性。

1．2 臍帶MSCs的分離培養(yǎng)及外周血單個核細胞(PBMC)的分離 ①臍帶MSCs的分離培養(yǎng):通過貼壁培養(yǎng)法分離、提純MSCs(表型 CD45陰性，CD105、CD44、CD29陽性，CD71弱陽性)，取第 3 代生長達80%融合的貼壁MSCs細胞，用0．25%胰蛋白酶消化，胎牛血清終止反應，吸管吹打，1 500 rpm/min離心5 min后去上清，加入無血清培養(yǎng)液稀釋進行計數(shù)，并調(diào)整細胞濃度為2×107/mL，離心后棄去無血清培養(yǎng)液，用稀釋液按倍數(shù)稀釋細胞備用。②PBMC的分離:將Hank's液與肝素鈉抗凝靜脈血等體積混勻，緩慢平鋪在比重為1．077的淋巴細胞分離液的表面，體積比為2∶1，形成清晰的界面;室溫下離心后管內(nèi)溶液分為三層，上層是血漿和Hank's液、中層為淋巴細胞分離液、下層主要為紅細胞和粒細胞等細胞，在上、中兩層界面處見一層以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，包括淋巴細胞和少量的單核細胞;用吸管輕輕將處于分層液面白膜狀的單個核細胞吸入另一離心管中，加入等量PBS液洗滌2次。將洗滌過的PBMC用L-DMEM重新懸浮，調(diào)節(jié)濃度備用。

1．3 體外MSCs與PBMC的混合培養(yǎng) 兩組均按MSC:PBMC 分別為 1∶1、1∶10、1∶50 的比例及單純PBMC的方式培養(yǎng)72 h。

1．4 PBMC 中 Th17 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(ROR-γt)mRNA的檢測 依據(jù)細胞特性(PBMC懸浮，MSCs貼壁)離心收集懸浮的PBMC，加入Trizol提取細胞沉淀，產(chǎn)物－70℃保存，其中一部分按說明書操作合成cRNA;PCR反應體系為20μL，上下游引物各250 nM(共1μL)及稀釋的cDNA 2μL，每個樣本設(shè)三個復孔，擴增條件為:85℃ 30 s，40個循環(huán)(85℃ 5 s，56℃ 31 s)。引物由上海生工生物技術(shù)工程公司合成，所用引物序列:ROR-γt上游引物 5'-CAGTGAGAGCCCAGAAGGAC-3'，下 游 引 物 5'-TCATCCCATCCATTTTTGGT-3'，擴增長度:139 bp;β-actin 上游引物5'-GGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游引物5'-GGAAGGTGGACAGCGAGG-3'擴增長度:98 bp。

1．5 PBMC中ROR-γt蛋白的檢測 采用West-bloting法。取于上述實驗提取的細胞沉淀，加入1 mL蛋白裂解液，注射器反復吹打約100次，4℃下10 000 g離心5 min，取上清，加入等體積2×SDS buffer，煮沸5 min，迅速冰浴。4℃離心10 min，留取上清用于后續(xù)檢測。SDS-PAGE電泳:濃縮膠恒壓80 V，時間約45 min;分離膠恒壓120 V，時間約3 h。PVDF膜活化:甲醇浸泡2 min，蒸餾水1 min，轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移緩沖液中。濕轉(zhuǎn)條件:恒流200 mA，2 h。5%BSA溶液4℃封閉過夜。一抗孵育:抗體稀釋度:鼠源(人標本)1∶1 000和鼠源 beta-actin(1∶1 000稀釋)，稀釋液:TBST;4℃過夜。二抗孵育:HRP標記抗鼠二抗1∶10 000稀釋(稀釋液為TBST，時間室溫2 h)。ECL底物化學發(fā)光顯色，掃描。Photoshop軟件測光密度值，收集數(shù)據(jù)。

1．6 混合培養(yǎng)液中細胞因子IL-17表達的檢測取12×75 mm FALCON上樣管，加入捕獲微球混懸液及Human Th17-PE信號抗體各50 mL，每管分別加入50 mL的檢測樣本，室溫下避光孵育3 h;每管加入1 mL洗液，1 500 rpm離心5 min，洗滌1次;每管加入300 mL洗液，重新懸浮微球。使用流式細胞儀分析樣本，當日上機，上機前充分混勻3～5 s;FACSComp程序進行儀器設(shè)置調(diào)整，CellQuest軟件獲取樣本數(shù)據(jù)，BDCBA軟件分析計算結(jié)果。

1．7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13．0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，常規(guī)進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，取LSD法進行兩兩比較;方差不齊時，采用DunnettT3進行兩兩比較。P≤0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 PBMC中ROR-γt mRNA的表達 與單獨PBMC培養(yǎng)者相比，RA組DAS28不同者PBMC混合培養(yǎng)后 ROR-γt mRNA的表達均有下降，(P均 ＜0．05)，其中 3．2 ＜ DAS28≤5．1 和 DAS28≤3．2 者混合培養(yǎng)比例不同時比較無顯著差異(P＞0．05)，DAS28＞5．1者混合培養(yǎng)比例不同時比較有顯著差異(P 均 ＜0．05，F(xiàn)=1．847);對照組 PBMC 混合培養(yǎng)后ROR-γt mRNA的表達無顯著變化，P＞0．05(F=1．516)。詳見表1。

表1 兩組PBMC中ROR-γt mRNA的表達比較±s)

表1 兩組PBMC中ROR-γt mRNA的表達比較±s)

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2．2 PBMC中 ROR-γt蛋白的表達 RA組 PBMC中ROR-γt蛋白的表達顯著高于對照組(P＜0．05)。在PBMC與MSCs以1∶1濃度培養(yǎng)后，DAS28 ＞5．1者ROR-γt蛋白的表達明顯下降，與單純培養(yǎng)者比較有顯著差異(P ＜0．05);3．2＜DAS28≤5．1和DAS28≤3．2 者 ROR-γt蛋白的表達下降，但與單純培養(yǎng)者比較無顯著差異(P＞0．05)。見表2。

2．3 培養(yǎng)液中IL-17水平 與PBMC單獨培養(yǎng)者相比，RA組DAS28 ＞5．1和3．2＜DAS≤5．1者混合培養(yǎng)后IL-17水平顯著下降，且存在MSCs濃度依賴性(P ＜0．05，F(xiàn)=28．441、11．743);RA 組 DAS28≤3．2者和對照組 IL-17水平無顯著變化(P＞0．05)。詳見表 3。

表2 兩組1∶1及PBMC單獨培養(yǎng)后PBMC中ROR-γt蛋白的表達(±s)

表2 兩組1∶1及PBMC單獨培養(yǎng)后PBMC中ROR-γt蛋白的表達(±s)

組別 n ROR-γt 蛋白的表達PBMC∶MSCs=1∶1 PBMC 單獨培養(yǎng)RA組18 DAS28≤3．2 6 0．53 ±0．02 0．56 ±0．21 3．2 ＜ DAS28≤5．1 6 0．90 ±0．42 0．85 ±0．04 DAS28 ＞5．1 6 0．88 ±0．02 1．10 ±0．06對照組6 0．52 ±0．04 0．53 ±0．02

3 討論

表3 兩組培養(yǎng)液中IL-17水平比較(ng/mL±s)

表3 兩組培養(yǎng)液中IL-17水平比較(ng/mL±s)

注:與 PBMC∶MSCs=1∶50 比較，*P ＜0．05;與 PBMC∶MSCs=1∶10 比較，△P ＜0．05;與單獨培養(yǎng)者比較，#P ＜0．05

組別 n IL-17單獨培養(yǎng)RA組水平PBMC∶MSCs=1∶50 PBMC∶MSCs=1∶10 PBMC∶MSCs=1∶1 PBMC 18 DAS28≤3．2 6 3．54 ±1．09 5．85 ±1．41 3．50 ±3．31 1．25 ± 0．34 3．2 ＜ DAS28≤5．1 6 7．88 ±6．68# 11．88 ±5．82*# 16．43 ±7．46*# 5．60 ± 2．80 DAS28 ＞5．1 6 10．67 ±9．08# 18．42 ±9．06*# 26．76 ±9．59＊△# 14．40 ± 2．70對照組6 3．63 ±2．52 3．34 ±0．25 6．95 ±2．05 51．35 ±13．13

既往研究發(fā)現(xiàn)，RA患者炎性關(guān)節(jié)局部有大量Th1細胞聚集，故一度被認為是以Th1細胞占主導地位的疾病。但近年研究發(fā)現(xiàn)，RA滑膜層存在能產(chǎn)生細胞因子IL-17的T淋巴細胞、滑液中高表達IL-17，膠原誘導關(guān)節(jié)炎(CIA)動物模型也證實IL-17通過促進炎性細胞因子IL-6、TNF-α的合成參與RA的炎癥反應過程，推測Th17細胞在RA發(fā)病中具有比 Th1 更為重要的作用［8，9］。Ivanov 等［10］研究認為，孤束核受體(RORγ)是Th17細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，小鼠缺乏RORγ時自身免疫性疾病發(fā)生率下降，Th17細胞數(shù)量也相應減少。Nurieva等［11］的實驗證明，IL-6能通過STAT3誘導Th17細胞分泌IL-21，而自分泌的 IL-21可通過 STAT3上調(diào)RORγ，誘導T細胞進一步向Th17細胞分化。同時IL-17在RA患者滑膜層可以通過刺激滑膜細胞表達分泌角質(zhì)細胞生長因子(KGF)等血管因子促進血管翳的形成，在RA的早期即發(fā)揮破壞作用［12，13］。有關(guān)人、鼠關(guān)節(jié)移植的研究提示，IL-17自身能夠刺激炎癥反應的發(fā)生，并使Th17細胞迅速產(chǎn)生，在炎癥急性期發(fā)揮一定作用［14］;還能通過誘導滑膜細胞和軟骨細胞表達金屬蛋白酶，使蛋白多糖分子斷裂，破壞軟骨組織;除促進炎性介質(zhì)如TNF-α、IL-1等分泌外，還可誘導NF-κB受體活化因子配基(RANKL)的表達，而RANKL是破骨細胞活化和骨質(zhì)吸收的必要條件［15，16］。因此，在骨質(zhì)破壞反應中 IL-17對破骨細胞的活化和骨質(zhì)的吸收方面發(fā)揮重要作用。

Kirkham等［17］進行的2 a的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，滑膜IL-17水平可作為RA關(guān)節(jié)損傷進展的檢測指標，同時與TNF-α有協(xié)同作用，尤適用于RA發(fā)病短期內(nèi)的檢測指標，關(guān)節(jié)腔滑膜中IL-17 mRNA的表達水平可預示損傷程度。在此基礎(chǔ)上，本研究觀察了體外臍帶MSCs培養(yǎng)對RA患者PBMC中Th17相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及細胞因子表達影響，旨在進一步尋找MSCs調(diào)控Th17細胞的可能機制。結(jié)果顯示，MSCs體外對RA患者PBMC中RORγt mRNA和蛋白水平均有一定抑制作用，尤其是在病情高度活動者，此種抑制效應呈劑量依賴性，但在緩解期患者未能看到此抑制效應。提示MSCs在體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)機制的發(fā)揮與內(nèi)環(huán)境的炎性刺激有關(guān)，此為MSCs在臨床應用中適應證的選擇提供了依據(jù);也提示這種抑制作用的發(fā)揮可能與基質(zhì)細胞的細胞接觸機制和分泌機制有關(guān)。本研究還顯示，RA組病情緩解者和對照組IL-17水平并未受到MSCs的抑制，但RA疾病活動者IL-17呈高表達，且高度活動者的抑制效應呈劑量依賴性。提示MSCs作為一種儲備細胞，正常生理狀態(tài)下其機能可能是靜止的，那么如何找到激活其調(diào)節(jié)功能的節(jié)點，尋找發(fā)揮其效能的有力干預措施尚需進一步深入研究。

最近，已經(jīng)有學者報道MSCs與IFN-γ等因子作用后免疫調(diào)節(jié)能力增強，更有學者已經(jīng)嘗試了采用IFN-γ刺激MSCs之后再用于治療GVHD，并取得了較好療效［18］。

綜上所述，臍帶MSCs體外培養(yǎng)能影響RA患者的Th17細胞調(diào)節(jié)機制，此為臨床RA的免疫調(diào)節(jié)治療提供了依據(jù)。

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