抗栓用參環(huán)毛蚓水提取方法的篩選

湯兵，孫勝宇，魏文揚，閻婷

(遼寧醫(yī)學院藥學院，遼寧 錦州 121001)

參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)為巨蚓科Megascolecidae 環(huán)毛屬Pheretima 動物。習稱廣地龍，為常用中藥，中藥地龍在中國藥典中收錄的品種還有通俗環(huán)毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉環(huán)毛蚓Pheretima guillelmi (Michaelsen)，櫛盲環(huán)毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen 的干燥體。后三者習稱為“滬地龍”［1］。蚯蚓始載于《神農本草經(jīng)》，性寒，味咸，歸肝、脾、膀胱經(jīng)。具有清熱定驚、通絡、平喘、利尿之功效。2010 版藥典對參環(huán)毛蚓質量控制只有性狀和理化鑒別，未有含量測定項。本實驗利用溶栓活性的效價測定方法對其水提工藝進行考察，彌補了藥典的不足，為把參環(huán)毛蚓開發(fā)成為抗栓新藥提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

儀器:培養(yǎng)箱(美國科峻儀器公司)，高速冷凍離心機(美國索福儀器公司)，培養(yǎng)皿，游標卡尺。

試藥:參環(huán)毛蚓購于廣西，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學楊松松教授鑒定為參環(huán)毛蚓Pheretima asperillum(E.perrier)的正品;凝血酶 (批號:200921)、纖維蛋白原 (批號:200827)、尿激酶 (批號:200918)均購自中國藥品生物制品檢定所，重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 正交試驗設計

根據(jù)水提預實驗結果，地龍藥材粉碎，采用水為提取溶劑，選取加水量(A)、提取時間(B)、提取次數(shù)(C)為考察因素，每個因素選取3 個水平，進行正交試驗。因素水平見表1。

表1 因素水平表

2.2 試驗方法及考察指標

取鮮品地龍9 份，每份10 g，按正交設計表進行試驗，加水后，浸泡，離心，吸取上清液，分別合并上清液，加水至100 mL，搖勻，精密吸取2 mL，至10 mL 的量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為供試品溶液。為保證產品質量的可控性及先進性，以反映產品質量的主要試驗數(shù)據(jù)即表示溶栓效價的溶圈大小作為考察指標。

2.3 溶栓效價的測定

2.3.1 纖維蛋白平板的制備

纖維蛋白原溶液 取牛纖維蛋白原標準試劑適量(以可凝固蛋白計)，加生理鹽水－磷酸緩沖液(pH=7.8)的稀釋液(16∶1)的混合液，制成每1 mL 中含可凝固蛋白2.5 mg 的溶液，即為纖維蛋白原溶液。

凝血酶溶液 取牛凝血酶標準試劑適量，加磷酸鹽緩沖液(pH =7.8)稀釋液，制成每1 mL 含凝血酶30BP 的溶液，即得凝血酶溶液。

纖維蛋白平板的制備 取直徑10.0 cm 的空白平皿，置水平的玻璃板上，加纖維蛋白原溶液15 mL，快速滴入凝血酶溶液0.3 mL，邊加邊平行快速搖勻，靜置30 min，使其凝固，備用。

2.3.2 對照品溶液的制備

取尿激酶對照品，加生理鹽水使溶解，振搖，制成每1 mL 含尿激酶100 U 的溶液。

2.3.3 測定法

精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，點于同一預先制備好的平板上，于37 ℃恒溫條件下放置18 h，用卡尺精密量出各流份及對照液的溶圈直徑及垂直于最大直徑的另一直徑，按下式計算效價。

溶圈面積= (溶圈兩直徑的平均值)2

測定結果見表2，方差分析見表3。

表3 方差分析結果

由試驗結果的方差分析表3 得出，提取次數(shù)(C 因素)與加水量(A 因素)為顯著性因素，從直觀分析極差中可看出，影響本實驗的主要因素C＞A ＞B，即:提取次數(shù)＞加水量＞提取時間。但考慮到生產實際及成本，生產的下一步應是冷凍干燥，應盡量減少水分的增加，所以本工藝定為提取2 次，第一次加水4 倍量，浸泡30 min，離心，取上清液，第2 次加水3 倍量，浸泡30 min，離心，取上清液，合并上清液，冷凍干燥，即得。

2.4 驗證實驗

按優(yōu)選工藝進行驗證實驗，結果表明參環(huán)毛蚓中溶栓活性以尿激酶效價計，為300 U/g。結果表明該工藝穩(wěn)定可靠。

3 討 論

蚯蚓具有溶栓作用，其有效成分是蛋白酶［2－3］，因此水提取有效成分含量較高。可考慮進一步用鹽析法精制，以提高溶栓效價。

［1］國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典一部［S］.中國醫(yī)藥科技出版社，2010:113.

［2］孫秀英，王富珍，王福星.中藥地龍研究進展［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2009，16 (5):102.

［3］張東方，周美環(huán)，單玉，等.參環(huán)毛蚓中纖溶活性蛋白酶研究［J］.藥物生物技術，2006，13 (1):49－50.