FOX基因捕獲技術(shù)在植物中的研究進(jìn)展與應(yīng)用

劉亞運(yùn)， 吳金霞， 路鐵剛

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

FOX基因捕獲技術(shù)在植物中的研究進(jìn)展與應(yīng)用

劉亞運(yùn)， 吳金霞， 路鐵剛?

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

利用功能獲得突變技術(shù)已在模式植物擬南芥與水稻中獲得了大量的突變?nèi)后w，通過對(duì)這些突變?nèi)后w進(jìn)行研究分析，極大促進(jìn)了擬南芥與水稻基因功能的研究。其中FOX基因捕獲技術(shù)是利用單一或者有限數(shù)量的全長cDNA使植物基因異位表達(dá)，從而系統(tǒng)地獲得功能獲得型突變體。FOX技術(shù)不但在擬南芥、水稻等模式植物中的應(yīng)用日趨成熟，同時(shí)在其他植物物種內(nèi)的研究也已取得極大的進(jìn)展。

功能獲得突變；FOX基因捕獲技術(shù)；研究進(jìn)展

在全基因組水平上誘發(fā)突變體的產(chǎn)生以及突變體材料的收集為功能基因組學(xué)的研究搭建了技術(shù)平臺(tái)［1］。目前在全基因組水平上利用物理化學(xué)誘變［2］、插入突變包括T?DNA插入突變［3］和轉(zhuǎn)座子插入突變［4］等方法創(chuàng)制功能缺失型突變體以及利用激活標(biāo)簽技術(shù)（activation tagging technol?ogy）和FOX捕獲系統(tǒng)（full?length cDNA over?ex?pression gene hunting system）創(chuàng)制功能獲得型突變體［5～8］已經(jīng)成為人工創(chuàng)制突變體的主要途徑。本文著重介紹了FOX捕獲系統(tǒng)的基本原理以及在研究植物基因功能方面的應(yīng)用。FOX系統(tǒng)利用單一或者有限數(shù)量的全長cDNA使植物基因異位表達(dá)，從而系統(tǒng)地獲得功能獲得型突變體。

1 FOX技術(shù)的原理與創(chuàng)建

激活標(biāo)簽系統(tǒng)是一種有效建立大規(guī)模功能獲得突變體庫的手段，但是這種系統(tǒng)具有一些缺點(diǎn)，因?yàn)樵诨蚪M上插入轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的效果受臨近增強(qiáng)子的多個(gè)基因的變化影響［9］。最近幾年來，多個(gè)種類的植物fl?cDNA（全長cDNA）克隆已經(jīng)獲得。擬南芥fl?cDNA群體，也被稱為“RIKEN擬南芥全長（RAFL）cDNA克隆”，已經(jīng)被構(gòu)建并測(cè)序完成［10］。Ichikawa等［5］在此基礎(chǔ)上開發(fā)了一種新型的功能獲得性研究方法，并命名為“the FOX gene hunting system”，利用單一或者有限數(shù)量的全長cDNA使植物基因異位表達(dá)，從而系統(tǒng)地獲得功能獲得型突變體。該技術(shù)可以產(chǎn)生大量的顯性突變體。擬南芥FOX庫的構(gòu)建流程可見圖1。

圖1 FOX gene hunting system的基本技術(shù)路線Fig．1 The basic technical line of FOX gene hunting system．

2 FOX技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用

2．1 FOX技術(shù)在模式植物擬南芥與水稻中的發(fā)展與應(yīng)用

Ichikawa等［5］將大約10 000個(gè)獨(dú)立的擬南芥cDNA與CaMV 35S控制下的轉(zhuǎn)化載體相連結(jié)，通過遺傳轉(zhuǎn)化將這個(gè)cDNA表達(dá)庫導(dǎo)入擬南芥體內(nèi)，從而得到大概 15 000個(gè)表達(dá)擬南芥全長cDNA的轉(zhuǎn)基因植株（擬南芥FOX?line）。這些全長cDNA被整合到一個(gè)植物表達(dá)載體中構(gòu)建了一個(gè)FOX農(nóng)桿菌庫。通過浸花法把每個(gè)擬南芥全長cDNA轉(zhuǎn)化到擬南芥植株中。Sothern雜交檢測(cè)分析表明每個(gè)轉(zhuǎn)基因系平均含有2．6個(gè)cDNA克隆，大小在0．3～4．2 kb之間，平均為1．4 kb。cDNA的大小平均值和分布范圍與在擬南芥fl?cDNA中隨機(jī)挑選的 277個(gè) fl?cDNA非常接近［5］。FOX技術(shù)可以使每個(gè)插入基因通過表型得到系統(tǒng)的分析研究。這些明顯的表型包括：形態(tài)、生長速率、葉片顏色、花期和生育力的明顯改變。在擬南芥FOX?line中，形態(tài)上的突變體（總轉(zhuǎn)化植株的9%）的出現(xiàn)高于激活標(biāo)簽體系（總轉(zhuǎn)化植株的2%）。

闡明脅迫相關(guān)基因的功能是該技術(shù)的主要應(yīng)用之一。通過構(gòu)建一個(gè)包括各種基于脅迫表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子文庫（小規(guī)模FOX系統(tǒng)）并且進(jìn)行分析［6］，擬南芥中 43個(gè)脅迫誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子 fl?cDNA被混合并轉(zhuǎn)化224個(gè)植株，經(jīng)過高鹽脅迫培養(yǎng)觀察，所有的耐鹽系都存活并保持葉片綠色。由于擬南芥擁有高轉(zhuǎn)化效率和短生長周期的優(yōu)點(diǎn)，可以利用擬南芥作為FOX捕獲系統(tǒng)的寄主用以闡明其他植物的基因功能。

多達(dá)28 000條獨(dú)立的水稻fl?cDNA已經(jīng)被農(nóng)業(yè)生物資源研究所（National Institute of Agrobio?logical Sciences，NIAS，日本）收集［11］。利用約13 000條獨(dú)立的水稻fl?cDNA，水稻?擬南芥FOX轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)已經(jīng)構(gòu)建成功。這些轉(zhuǎn)基因系是在CaMV35S啟動(dòng)子控制下，水稻fl?cDNA轉(zhuǎn)化擬南芥而構(gòu)成的［7］。Koudou等［7］已經(jīng)建立了多達(dá)23 000個(gè)獨(dú)立的水稻FOX擬南芥轉(zhuǎn)基因系。PCR檢測(cè)分析，平均每個(gè)植物包括 1．1個(gè)水稻fl?cDNA，其大小在0．5～4．5 kb之間。這些水稻FOX擬南芥轉(zhuǎn)基因系被用于大規(guī)模的表型檢測(cè)，如：可見的表型、光合作用活性、礦質(zhì)元素積累、色素積累、激素功能、抗生物脅迫、耐鹽脅迫與耐高溫脅迫、抗紫外脅迫與高光耐受等。在可見表型的突變體，1 297個(gè)突變系（約5%）被從23 715個(gè)T1代轉(zhuǎn)基因系中分離出來。從這些突變體擴(kuò)增出fl?cDNA重新轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，大約有一半表型重現(xiàn)（48%）。其中的一些水稻fl?cDNA被轉(zhuǎn)入水稻中，22%的轉(zhuǎn)基因后代產(chǎn)生了在擬南芥FOX系中檢測(cè)到的同樣表型。

Nakamura等人［8］建立了將近12 000個(gè)表達(dá)水稻fl?cDNA的水稻FOX?lines，每個(gè)水稻FOX?line平均含有1．04個(gè)水稻fl?cDNA，平均大小為1．66 kb。通過對(duì)238個(gè)水稻FOX?lines的檢測(cè)表明，其平均FOX?lines大小接近原本水稻fl?cDNA庫的平均大小。在 T0代就看見明顯的突變體。在9 012個(gè)FOX?lines中共有1 496個(gè)轉(zhuǎn)基因系表型發(fā)生了明顯的改變。在水稻FOX?lines出現(xiàn)的表型主要有：矮化、致死、類病變、葉色淺、愈傷組織綠化、葉窄和高倍分蘗等。

2．2 利用FOX技術(shù)對(duì)其他植物物種中的研究應(yīng)用

盡管對(duì)于基因功能的分析基本都聚焦在擬南芥與水稻這些模式植物中，但許多其他物種在特定酶的作用下產(chǎn)生特異的化學(xué)物或者綜合代謝產(chǎn)物。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，許多植物物種的基因組測(cè)序已完成。然而，有些特別植物的基因功能研究仍進(jìn)展緩慢，并且這些物種的轉(zhuǎn)化很困難。這些作物基因功能的分析研究通常讓研究者們花費(fèi)大量的時(shí)間和精力在植株的轉(zhuǎn)化和組織培養(yǎng)上。FOX技術(shù)為此帶來了更方便的研究方法。對(duì)于具有較大基因組的物種如玉米和小麥來說，這種方法具有更大的優(yōu)勢(shì)。因此，F(xiàn)OX技術(shù)不僅是一種好的基礎(chǔ)研究方法，而且在植物相關(guān)有益表型的研究方面具有極大的潛力。FOX技術(shù)得到的后代所引起的表型變化是由基因插入引起的，因?yàn)閒l?cDNA是在CaMV 35S啟動(dòng)子以及NOS終止子的之間正向表達(dá)［12］。最近，從黃豆、木薯、白楊和日本柳杉等多種植物中提取的fl?cDNA已經(jīng)克隆得到［13～15］。FOX捕獲系統(tǒng)可能會(huì)是獲取這些植物的功能獲得型突變體的一種替代手段。例如在擬南芥中，利用飽和誘變的功能缺失研究和FOX捕獲系統(tǒng)的功能獲得研究可以用來進(jìn)行基于基因的表型分析。在水稻中的相關(guān)研究發(fā)展也已經(jīng)迅速的接近擬南芥。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)與生物信息學(xué)的發(fā)展，在許多其他作物或者蔬菜的研究也已經(jīng)開展，這對(duì)改善糧食的供應(yīng)與質(zhì)量的提高有著重要意義。

2．3 FOX技術(shù)的相關(guān)資源與數(shù)據(jù)庫

根據(jù)FOX技術(shù)已獲得的材料，科學(xué)家們構(gòu)建了相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫資源，這些數(shù)據(jù)庫中不但包含了轉(zhuǎn)基因植株的全長cDNA插入位點(diǎn)，還囊括了轉(zhuǎn)基因后代的一共8個(gè)大類24個(gè)子類的顯著表型。這些數(shù)據(jù)庫的更新信息都能從水稻功能基因數(shù)據(jù)庫中查明（RiceGE）（http：／／signal．salk．edu／cgi?bin／RiceGE）。FOX技術(shù)相關(guān)的公共數(shù)據(jù)庫信息見表1。

表1 FOX技術(shù)相關(guān)的公共數(shù)據(jù)庫Table 1 The databases of FOX gene hunting system．

3 展望

各種突變體資源的利用都促進(jìn)了大規(guī)模的表型分析的發(fā)展?；旧希δ苋笔蛔兛梢蚍€(wěn)定的遺傳而且可以達(dá)到飽和誘變。基于突變資源的基因型-表型分析是可行的，這點(diǎn)已經(jīng)在擬南芥和水稻中得到了充分的驗(yàn)證。一旦在缺失突變中找到明顯的表型，就能夠分離出直接導(dǎo)致這個(gè)表型的基因。然而，只有極少數(shù)的突變有明顯的表型，特別是單基因突變，這是因?yàn)橹貜?fù)基因或者基因家族的功能冗余所造成的結(jié)果。在擬南芥中基因組中，超過65%的預(yù)測(cè)蛋白屬于基因家族的成員，這些基因家族中每個(gè)至少含有兩個(gè)成員。與此相不同的是，功能獲得突變就可以克服功能冗余或致死表型所帶來的難題［16］。一旦誘導(dǎo)基因的效應(yīng)得到了證明，所獲得的結(jié)果很快就能應(yīng)用到作物中進(jìn)行研究。然而如果得到一個(gè)表型清晰的功能獲得突變體，與功能缺失突變相比，對(duì)于生物基因功能的研究并不容易，這是因?yàn)楣δ塬@得突變體的突變表型可能是由過表達(dá)基因的異位表達(dá)所造成。因此，功能獲得突變的表型需要經(jīng)過仔細(xì)的分析鑒定。在分析功能獲得突變表型時(shí)也要考慮到由于多代繁殖中對(duì)應(yīng)基因的共抑制所導(dǎo)致的基因沉默的可能性［17］。

FOX技術(shù)作為功能獲得突變技術(shù)新興的一種，不但對(duì)于模式植物的功能基因研究有著明顯的優(yōu)勢(shì)，并且對(duì)于較難轉(zhuǎn)化的物種的功能基因研究另辟蹊徑。本實(shí)驗(yàn)室就曾利用FOX技術(shù)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)在水稻中過表達(dá)小麥轉(zhuǎn)錄因子基因全長cDNA，獲得了大量的具有明顯表型的轉(zhuǎn)基因FOX后代［］，這對(duì)于小麥轉(zhuǎn)錄因子功能的研究以及水稻的品種改良都提供了廣闊的研究空間。

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Advance and Application of FOX Gene Hunting System in Plant

LIU Ya?yun，WU Jin?xia，LU Tie?gang?
Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China

Large numbers ofmutant plant populations have been generated by‘gain?of?function’techniques．Great progress have been made in Arabidopsis and rice through the use of these tools．Using a single or a limited number of full length cDNAs，F(xiàn)OX system makes gene ectopic expression in plant，accessing functionalmutants，especially the gain?of?function mutant．The FOX gene hunting system have beenmaturely used notonly inmodel plantspecies，such as Arabidopsis and rice，butalso in other plant species．

gain?of?function mutants；FOX gene hunting system；progress

10．3969／j．issn．2095?2341．2013．05．03

2013?08?14；接受日期：2013?09?10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C1306）資助。

劉亞運(yùn)，碩士研究生，主要從事植物分子生物學(xué)與基因工程研究。E?mail：liuyayunxx＠163．com。?通信作者：路鐵剛，研究員，主要從事植物分子生物學(xué)與基因工程研究。E?mail：lutiegang＠caas．cn