噴司他丁發(fā)酵條件的優(yōu)化

鄒 昕

福建省微生物研究所，福州350007

噴司他丁發(fā)酵條件的優(yōu)化

鄒 昕

福建省微生物研究所，福州350007

噴司他丁是一種抗腫瘤藥物，主要以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)。本研究對(duì)噴司他丁發(fā)酵的通氣量、培養(yǎng)溫度、接種量、種齡、發(fā)酵周期等參數(shù)進(jìn)行單因素考察，并通過(guò)正交試驗(yàn)確定了噴司他丁最佳發(fā)酵參數(shù)為：裝量60 mL，種齡42 h，按5%接種量，28℃下發(fā)酵168 h，噴司他丁發(fā)酵效價(jià)達(dá)183μg／mL，比對(duì)照提高20%以上。

噴司他??；發(fā)酵；工藝；正交試驗(yàn)

噴司他?。╬entostatin）是 1974年 Warner?Lambert等［1］從 土 壤 微 生 物 Streptomyces antibioticus中分離得到的一種擬嘌呤類的抗腫瘤藥，為白色結(jié)晶。該藥物于1992年首先在美國(guó)上市，1998年2月美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)注射粉針制劑噴司他丁上市。噴司他丁可用于治療干細(xì)胞白血病、慢性淋細(xì)胞白血病和覃樣霉菌病等，其作用機(jī)制為：通過(guò)抑制人體內(nèi)的腺苷脫氨酶（ADA）活性，使腫瘤細(xì)胞大量積累脫氧腺苷和5′?三磷酸脫氧腺苷（dATP），從而抑制DNA或RNA的合成，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡［2］。近年來(lái)的研究表明，噴司他丁不僅是有效的抗腫瘤藥物，而且可能是很有前途的免疫抑制劑［3］。如采用噴司他丁與Rituximab聯(lián)合應(yīng)用治療低度惡性B細(xì)胞淋巴瘤，初步結(jié)果顯示其有效率（CR＋PR）達(dá)70%，尚有15%患者穩(wěn)定（SD），且患者容易耐受［4］。美國(guó)研究人員還發(fā)現(xiàn)采用噴司他丁結(jié)合紫外線治療有助于腫瘤病人骨髓移植［4］。美國(guó)SuperGen公司最近宣布，臨床研究顯示，噴司他丁可以有效治療兒童慢性移植物抗宿主?。╟GVHD），由于療效顯著目前在市場(chǎng)運(yùn)用越來(lái)越廣泛，目前對(duì)其適應(yīng)癥的研究還在不斷進(jìn)行［5，6］。

目前已報(bào)到的噴司他丁的制備方法有兩種，微生物發(fā)酵法和化學(xué)合成法［7］。兩種制備方法各有優(yōu)劣，但以微生物發(fā)酵法更為經(jīng)濟(jì)，現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)以微生物發(fā)酵法為主。微生物發(fā)酵法產(chǎn)量的高低不僅取決于菌株的單位水平、培養(yǎng)基的組成，還與發(fā)酵的培養(yǎng)條件有很大的關(guān)系［8～12］。本文在對(duì)噴司他丁微生物發(fā)酵的溫度、裝量、接種量、種齡、發(fā)酵周期的單因素研究基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)來(lái)獲取最佳的培養(yǎng)條件，減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，提高工藝優(yōu)化的效率，最終提高了噴司他丁的發(fā)酵產(chǎn)量。

1 材料和方法

1．1 菌種和培養(yǎng)基

噴司他丁產(chǎn)生菌（Streptomyces antiboticus）FIM06?063，由福建省微生物研究所提供。

1．2 培養(yǎng)基［13，14］

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖10 g／L，酪蛋白3 g／L，酵母粉3 g／L，瓊脂15 g／L。使用茄子瓶分裝培養(yǎng)基，121℃蒸汽滅菌30 min，滅菌后將茄子瓶?jī)A斜擺放，制成斜面。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g／L，酪蛋白3 g／L，酵母粉3 g／L。分裝于500mL三角瓶中，121℃蒸汽滅菌30 min備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖3 g／L，黃豆粉35 g／L，酵母粉2．5 g／L，碳酸鈣3．5 g／L，棉子油7．5 g／L。分裝于500 mL三角瓶中，121℃蒸汽滅菌30 min備用。

1．3 噴司他丁產(chǎn)生菌的發(fā)酵

在無(wú)菌操作環(huán)境下，用無(wú)菌不銹鋼勺從噴司他丁沙土管中取少許沙土，涂布在空白茄子瓶斜面上，涂抹時(shí)要均勻，使其生長(zhǎng)一致，塞好棉塞。斜面于28℃培養(yǎng)15 h。取生長(zhǎng)良好的茄子瓶菌種斜面，用接種針刮取斜面上的孢子至搖瓶種子瓶中，每瓶的孢子刮取面積約為1 cm2，搖瓶培養(yǎng)一定的時(shí)間后再接入發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中搖瓶培養(yǎng)。搖瓶的基本發(fā)酵條件為：28℃、200 r／min搖床振蕩培養(yǎng)，每瓶裝60 mL培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)54 h，發(fā)酵接種量為5mL／60mL（7．7%），發(fā)酵周期144 h。

1．4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1．4．1 單因素考察 分別考察溫度、裝量、接種量、種齡和發(fā)酵周期5個(gè)不同因素對(duì)發(fā)酵的結(jié)果影響［15～17］。溫度設(shè)置 24℃、26℃、28℃、30℃和32℃共5個(gè)處理，考察溫度對(duì)發(fā)酵的影響。裝量不同對(duì)應(yīng)不同通氣量水平，在500 mL三角瓶中分別加入30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL、110 mL和120 mL發(fā)酵液進(jìn)行培養(yǎng)，獲得最佳裝量水平。接種量考察了1mL／60mL（1．6%）、2mL／60mL（3．2%）、3mL／60mL（4．8%）、 4mL／60mL （6．2%）、 5mL／60mL（7．7%）、7．5mL／60mL （11%）、10mL／60mL（14%）和12mL／60mL（17%）共8個(gè)不同水平，確定最佳接種量。種齡試驗(yàn)分別選用36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、66 h、72 h和78h共8個(gè)處理進(jìn)行試驗(yàn)，考察種子培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響。發(fā)酵周期試驗(yàn)分別在48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h、120 h、132 h、144 h、156 h、168 h、180 h、192 h、204 h和216 h時(shí)取樣進(jìn)行效價(jià)考察，由此確定最佳發(fā)酵周期。

1．4．2 正交實(shí)驗(yàn) 在28℃條件下，對(duì)裝量、種齡、接種量、發(fā)酵周期4因素，取單因素實(shí)驗(yàn)中最佳3種結(jié)果為不同水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，進(jìn)行噴司他丁發(fā)酵效價(jià)檢測(cè)［18］，確定最佳發(fā)酵參數(shù)。

1．5 發(fā)酵效價(jià)的測(cè)定

采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定發(fā)酵液中噴司他丁的效價(jià)。

1．5．1 樣品制備 取10 mL發(fā)酵液，用中速定性濾紙初濾后吸取1mL濾液于50mL容量瓶中，加流動(dòng)相定容，混勻，用0．45μm膜過(guò)濾，濾液即為HPLC測(cè)定樣品［19，20］。

1．5．2 HPLC測(cè)定條件 實(shí)驗(yàn)采用島津公司產(chǎn)10AVp型高效液相色譜儀，色譜柱為250 mm× 4．6 mm，5μm，C8色譜柱（Phenomenex公司），預(yù)柱為4 mm×3．0 mm，C8色譜柱（Phenomenex公司）。精密吸取樣品溶液10μL注入高效液相色譜儀，柱溫20℃，流動(dòng)相為：磷酸氫二銨∶甲醇∶乙腈＝950∶25∶25［21，22］，流速為1．0 mL／min，紫外282 nm和270 nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)。

1．5．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 將噴司他丁標(biāo)準(zhǔn)譜系列稀釋后進(jìn)行 HPLC測(cè)定，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 噴司他丁HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．1 Pentostatin HPLC standard curve．

1．5．4 樣品的測(cè)定 發(fā)酵液樣品進(jìn)行HPLC測(cè)定，記錄色譜圖，噴司他丁的保留時(shí)間為8．5 min左右，按面積歸一法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算發(fā)酵液中噴司他丁的效價(jià)，發(fā)酵液HPLC色譜圖見(jiàn)圖2。

2 結(jié)果與分析

2．1 最佳溫度的選擇

比較不同溫度條件下噴司他丁發(fā)酵的情況，設(shè)置24℃、26℃、28℃、30℃和32℃共5種溫度條件，其他培養(yǎng)條件不變實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。溫度對(duì)效價(jià)的影響明顯，在24℃～26℃區(qū)間，效價(jià)增長(zhǎng)明顯，28℃時(shí)達(dá)到最大。溫度超過(guò)30℃后效價(jià)迅速下降?？沙醪酱_定26～28℃溫度區(qū)間是噴司他丁產(chǎn)生菌的最適發(fā)酵溫度區(qū)間。

2．2 最佳通氣量的選擇

噴司他丁產(chǎn)生菌（菌種名稱）為好氧微生物，菌體在自身生長(zhǎng)、繁殖及合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的過(guò)程中都需要一定量氧氣。發(fā)酵罐上可以通過(guò)調(diào)節(jié)空氣流量和不同的攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)控制通氣量［23］，實(shí)驗(yàn)室搖瓶發(fā)酵則通過(guò)控制搖床轉(zhuǎn)速和改變搖瓶裝液量來(lái)模擬不同的通氣量。在其他基本發(fā)酵條件不變的情況下，分別在500 mL三角瓶中加入30～120 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，在固定轉(zhuǎn)速200 r／min的搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，考察通氣量對(duì)發(fā)酵效價(jià)影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。裝量在30～60mL時(shí)，效價(jià)曲線比較平穩(wěn)，呈現(xiàn)一個(gè)上升趨勢(shì)，當(dāng)裝量超過(guò)60mL后下降趨勢(shì)明顯?？梢?jiàn)，噴司他丁產(chǎn)生菌的發(fā)酵對(duì)通氣量有一定需求，但通氣量并非越高越好，過(guò)大會(huì)造成菌絲早衰而斷裂成碎片，發(fā)酵提前終止的現(xiàn)象。因此60 mL是比較適合的裝量。

圖2 噴司他丁發(fā)酵液HPLC色譜圖Fig．2 HPLC chromatograms of pentostatin fermention broth．

圖3 溫度對(duì)噴司他丁發(fā)酵的影響Fig．3 Effect of temperature on pentostatin fermentation．

圖4 通氣量對(duì)噴司他丁發(fā)酵的影響Fig．4 Effect of ventilation on pentostatin fermentation．

2．3 最佳接種量的選擇

在發(fā)酵過(guò)程中，接種量影響發(fā)酵液中的菌濃度。將噴司他丁種子液按不同接種量（1．6%～17%）接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，考察接種量對(duì)發(fā)酵的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。當(dāng)接種量為1．6%～4．8%時(shí)，效價(jià)平穩(wěn)增加，接種量超過(guò)4．8%后，效價(jià)逐步下降，初步確定3mL／60mL（4．8%）為最佳的接種量。

圖5 接種量對(duì)噴司他丁發(fā)酵的影響Fig．5 Effect of inoculum volume on pentostatin fermentation．

2．4 最佳種齡的選擇

種齡過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都將直接影響發(fā)酵水平。種齡過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起菌體過(guò)早自溶，導(dǎo)致產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降；種齡過(guò)短，會(huì)造成發(fā)酵菌絲生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵周期延遲，增加動(dòng)力消耗。噴司他丁的種齡試驗(yàn)分別選用36～78 h的種子進(jìn)行試驗(yàn)，在其他發(fā)酵條件不變的情況下，考察種子培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可以看出，噴司他丁種子液培養(yǎng)42 h可獲得最高效價(jià)，初步確定42 h為最佳的種齡。

圖6 種齡對(duì)噴司他丁發(fā)酵的影響Fig．6 Effect of seed age on pentostatin fermentation．

2．5 最佳發(fā)酵周期的選擇

最佳發(fā)酵周期的確定就是選擇發(fā)酵罐放罐的最佳時(shí)機(jī)。一般認(rèn)為發(fā)酵周期的確定有三個(gè)原則：發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn)物的最大化；發(fā)酵成本的最低；對(duì)后續(xù)提取最有利。噴司他丁最佳發(fā)酵周期試驗(yàn)選擇48～216 h中取樣檢測(cè)噴司他丁的發(fā)酵效價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。可以看出，發(fā)酵周期在168 h時(shí)效價(jià)最高，之后效價(jià)后迅速下降，說(shuō)明產(chǎn)物的分解也非常迅速。所以，168 h可做為最佳發(fā)酵周期。在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，最佳發(fā)酵周期除了考慮獲取最高效價(jià)外還需考慮到對(duì)發(fā)酵液后續(xù)提取最有利和最低發(fā)酵成本等因素，還需根據(jù)具體情況調(diào)整。

圖7 發(fā)酵周期對(duì)噴司他丁發(fā)酵的影響Fig．7 Effect of time on pentostatin fermentation．

2．6 發(fā)酵工藝的正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)是基于數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)原理科學(xué)合理的安排實(shí)驗(yàn)，并按一定規(guī)律分析處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從而能較快的找到工藝的最佳條件，且具有可判斷諸多因素中何種因素是主要因素，以及判斷影響因素之間的相互影響情況等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置L9（34）正交試驗(yàn)，溫度選擇28℃，考察的四因素為裝量、種齡、接種量和發(fā)酵周期，各因素選擇三水平，見(jiàn)表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表1 正交試驗(yàn)的水平和因素Table 1 Levels and factors orthogonal test．

從表2中的數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，極差值RC＞RA＞RB＞RD，由此可見(jiàn)對(duì)噴司他丁效價(jià)影響最大的因素是接種量，其次是裝量（通氣量），再次是種齡和發(fā)酵周期。比較K值，最佳組合為A2B2C2D3，即裝量60 mL，種齡42 h，接種量5%，發(fā)酵周期168 h。由表3方差分析可知，接種量是影響噴司他丁發(fā)酵效價(jià)的極顯著因素，另外裝量是影響噴司他丁發(fā)酵效價(jià)的顯著因素，而種齡和發(fā)酵周期對(duì)噴司他丁發(fā)酵影響不顯著。極差和方差分析結(jié)果相互映證。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment．

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment．

2．7 噴司他丁的發(fā)酵

按最佳條件進(jìn)行發(fā)酵工藝驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次，噴司他丁效價(jià)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。在未改進(jìn)發(fā)酵條件下的噴司他丁對(duì)照組效價(jià)為151（μg／mL），優(yōu)化后發(fā)酵條件后噴司他丁效價(jià)為183（μg／mL），比對(duì)照組提高了20%以上。

表4 噴司他丁優(yōu)化發(fā)酵工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Pentostatin fermentation result after optimization of fermentiation process．

3 討論

pH、溫度、裝量、接種量、種齡和發(fā)酵周期等是發(fā)酵過(guò)程中的重要參數(shù)，對(duì)產(chǎn)物效價(jià)有直接影響。本研究未考察pH的影響，對(duì)其他因素逐一進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)考察，發(fā)現(xiàn)最佳溫度為28℃，最佳裝量為60 mL，最佳接種量為4．8%，最佳種齡為42 h，發(fā)酵周期為168 h。通過(guò)運(yùn)用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)一步確定了噴司他丁最佳發(fā)酵條件，優(yōu)化條件下，噴司他丁的效價(jià)達(dá)183μg／mL，比未優(yōu)化前提高了20%，有助于進(jìn)一步擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)規(guī)模，進(jìn)入中試生產(chǎn)，為噴司他丁的生產(chǎn)應(yīng)用積累數(shù)據(jù)資料。

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Optim ization of Pentostatin Fermentation Conditions

ZOU Xin
Fujian Institute ofMicrobiology，F(xiàn)uzhou 350007，China

Pentostatin is an anticancer drug，mainly produced by microbial fermentation．In this study，fermentation ventilation，temperature，inoculum，seed age，and other parameters of the fermentation cycle were discussed，then a orthogonal experiment was done to determine the optimum fermentation parameters：loading volume of60mL，seed age of42 h，5%inoculum，28℃for 168 h fermentation，pentostatin fermentation titer reached 183μg／mL，which was increased by 20%compared to the control．

pentostatin；fermentation；technology；orthogonal experiment

10．3969／j．issn．2095?2341．2013．05．12

2013?05?22；接受日期：2013?08?22

鄒昕，工程師，研究方向?yàn)槊庖咭种苿┪⑸锇l(fā)酵。E?mail：fjfzzouxin＠126．com