Gd-DOTA-hTERT ASON 磁共振腫瘤端粒酶靶向顯像實(shí)驗(yàn)研究

朱高紅任炳秀衛(wèi)江亮蘇玉林何蕊張威蔡靜宋彬

1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，云南 昆明，650032;

2.四川大學(xué)華西醫(yī)院放射科，四川 成都，610041;

3.四川省腫瘤醫(yī)院放射科，四川 成都，610043

Gd-DOTA-hTERT ASON 磁共振腫瘤端粒酶靶向顯像實(shí)驗(yàn)研究

朱高紅1任炳秀1衛(wèi)江亮1蘇玉林1何蕊1張威3蔡靜1宋彬2

1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，云南 昆明，650032;

2.四川大學(xué)華西醫(yī)院放射科，四川 成都，610041;

3.四川省腫瘤醫(yī)院放射科，四川 成都，610043

背景與目的：研究表明，約有超過85%的惡性腫瘤高表達(dá)端粒酶活性。因此，端粒酶已成為腫瘤診斷和治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。目前，以放射性核素標(biāo)記人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶反義寡核苷酸(human telomerase reverse transcriptase antisense oligonucleotide，hTERT ASON)對高表達(dá)hTERT的惡性腫瘤進(jìn)行靶向顯像在國內(nèi)外也有相關(guān)報(bào)道，但核醫(yī)學(xué)圖像在解剖和空間分辨率上存在著不足，難以獲得高質(zhì)量的圖像。因此，本研究擬以磁共振成像方法對活體內(nèi)腫瘤端粒酶的進(jìn)行檢測，并對其進(jìn)行可行性評價(jià)。方法：以DOTA(1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-N,N',N'',N'''-tetraacetic acid)為螯合劑對全鏈硫代修飾的hTERT ASON(3’末端連接一個(gè)伯氨)進(jìn)行Gd3+標(biāo)記制備反義探針并進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，以99mTc標(biāo)記的DOTA-hTERT ASON生物分布實(shí)驗(yàn)；建立人黑色素瘤A375裸鼠模型，分別于腹腔注射前及注射后0.5、1、2、4、6、24 h在7.0T Magnetic Resonance Imaging(MRI)下行T1WI顯像，以腫瘤及其周圍正常組織作為感興趣區(qū)(region of interest，ROI)計(jì)算信噪比(signal to noise ratio，SNR)并與Gd-DTPA進(jìn)行比較；顯像后48 h處死小鼠，以免疫組織化學(xué)方法檢測腫瘤組織端粒酶活性。結(jié)果：Gd-DOTA-hTERT ASON的標(biāo)記率約為65%，在37 ℃新鮮人血清中溫育24 h后，探針的降解率低于3%；A375細(xì)胞對探針的攝取約為8.5%，Gd-DOTA-hTERT ASON轉(zhuǎn)染的A375細(xì)胞信號強(qiáng)度明顯高于Gd-DTPA和DOTA-hTERT ASON組；腫瘤在注射反義探針和Gd-DTPA均表現(xiàn)為明顯強(qiáng)化，反義探針組SNR最高可達(dá)2.37，最大強(qiáng)化時(shí)間為注射后2～6 h，且可被DOTA-hTERT ASON所抑制(P＜0.05)，而Gd-DTPA組強(qiáng)化時(shí)間為注射后2 h；Gd-DOTA-hTERT ASON可抑制腫瘤端粒酶活性。結(jié)論：Gd-DOTA-hTERT ASON顯示了良好的腫瘤靶向性，對端粒酶陽性表達(dá)的腫瘤具有潛在的定性診斷價(jià)值。

反義探針；端粒酶；磁共振；腫瘤；DOTA

端粒是真核生物染色體末端的核蛋白結(jié)構(gòu)，由非編碼的DNA串聯(lián)線性己核苷酸(TTAGGG)n重復(fù)單元所組成［1-2］，具有防止染色體降解、重排及融合作用。在DNA合成過程中，傳統(tǒng)的DNA聚合酶不能完全復(fù)制前述線性DNA末端，因此，隨著細(xì)胞的分裂，端粒會越來越短，當(dāng)端粒長度達(dá)到Hanflick極限時(shí)，會激活p53和RB基因，細(xì)胞進(jìn)入復(fù)制衰老期(M1)，當(dāng)機(jī)體p53和RB基因功能失調(diào)時(shí)，M1期細(xì)胞將繼續(xù)分裂進(jìn)入危機(jī)期，此期細(xì)胞染色體處于急性不穩(wěn)定狀態(tài)，細(xì)胞大量凋亡，同時(shí)逃過凋亡的細(xì)胞將成為永生化細(xì)胞(癌細(xì)胞)［3-5］。

研究表明，端粒穩(wěn)定的維持是所有惡性腫瘤細(xì)胞最明顯的特征，有85%～90%的惡性腫瘤以激活端粒酶的方式來維持端粒的穩(wěn)定，而在正常體細(xì)胞中除活化了的淋巴細(xì)胞、生殖細(xì)胞外，幾乎檢測不到其活性，因此，端粒酶已成為腫瘤診斷和治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。端粒酶是一種核糖核蛋白酶，其核心催化區(qū)域或端粒酶元件(TERC)和一個(gè)蛋白催化亞單位-端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)所組成。端粒酶全酶通過TERC與端粒的重復(fù)序列相連接，并以TERC為模板合成端粒DNA重復(fù)序列［6-7］。

目前，對端粒酶的檢測主要有端粒酶擴(kuò)增(TRAP)法、實(shí)時(shí)PCR法(RT-PCR)和免疫組織化學(xué)染色法［8-10］，這些方法雖具有較高的敏感性和特異性，但其具有創(chuàng)傷性和受到取材部位的限制，而傳統(tǒng)的影像檢查技術(shù)如X線計(jì)算機(jī)體層攝影(CT)、磁共振顯像(MRI)、超聲(US)等所顯示的疾病是基于分子、基因改變所導(dǎo)致的解剖學(xué)改變，因此無法對疾病進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷。

反義技術(shù)是根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，利用與目標(biāo)靶DNA或RNA特定互補(bǔ)的短鏈核苷酸(反義核苷酸)封閉基因表達(dá)的方法。而放射性核素反義顯像是利用放射性核素標(biāo)記與腫瘤過度表達(dá)的癌基因mRNA互補(bǔ)的人工合成的反義寡核苷酸作為顯像劑，通過體內(nèi)雜交，對特定的腫瘤癌基因進(jìn)行顯像。但核素反義顯像存在著解剖和空間分辨率不足，而MRI反義成像是繼放射性核素基因成像之后出現(xiàn)的無創(chuàng)性技術(shù)，其突出的特點(diǎn)是具有更高的解剖與空間分辨率。目前，以端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶為靶點(diǎn)的MRI反義成像目前未見相關(guān)報(bào)道。本研究以人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)作為感興趣靶點(diǎn)，以Gd3+標(biāo)記的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶反義寡核苷酸(hTERT ASON)對惡性腫瘤端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性進(jìn)行活體內(nèi)MRI顯像，以評價(jià)Gd-DOTA- hTERT ASON作為惡性腫瘤MRI靶向增強(qiáng)的可行性。

1 材料和方法

1.1 主要材料

全鏈硫代修飾的hTERT ASON(序列為：5’-TAGAGACGTGGCTCTTGA-3’購自金斯瑞公司(中國南京)，其3’端連接一個(gè)伯氨結(jié)構(gòu)，連接后結(jié)構(gòu)式為hTERT ASON-(CH2)7-NH2(相對分子質(zhì)量為5.5×103)，純化方式為聚丙烯凝膠電泳(PAGE)。99mTcO4-淋洗液由北京原子高科股份有限公司提供，N-羥丁基硫代琥珀酰亞胺( N-Hydroxysulfosuccinimide Sodium，Sulfo-NHS )購自日本TCI公司，1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸(1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-N,N',N'',N'''-tetraacetic acid，DOTA)購自日本TCI公司，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽［1-(3-Dimethylaminoptoply)-3-ethylcarbodimide hydrochloride，EDC］由Sigma Aldrich公司提供，6水氯化釓(GdCl3·6H2O)由Aladdin公司提供。

1.2 方法

1.2.1 DOTA-hTERT ASON的制備

分別取DOTA(4.0 mg，9.8 μmol)、 EDC(2 mg，10.4 μmol)、S-NHS(2 mg，9.2 μmol)溶于200 μL pH=5.5的磷酸緩沖液(PBS)中，室溫下振蕩反應(yīng)30 min，得到具有氨基反應(yīng)活性的中間體DOTA-NHS酯［11-12］，將活化后的DOTA以分子比DOTA:ASON 75:1，逐滴加入含有ASON (66 μg，22.6 nmol)的1.6 mL pH=8.5的PBS中，室溫下振蕩反應(yīng)4 h，將反應(yīng)液移入透析管(分子截留量：3.5×103)中，以pH=7.0的PBS作為透析液，透析9 h，每3 h換液1次，將純化后的DOTA-hTERT ASON分裝，保存于－20 ℃冰箱中。

1.2.2 DOTA-hTERT ASON的Gd3+標(biāo)記及質(zhì)控

將DOTA-hTERT ASON與GdCl3·6H2O按摩爾比1:1加入EP管中，將反應(yīng)液pH調(diào)至7.0，將EP管放入60 ℃恒溫水育箱中，振蕩反應(yīng)45 min。將一半的反應(yīng)液移入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2倍體積的0.5 mmol/L偶氮砷Ⅲ溶液和4倍體積的0.2 mmol/L鹽酸，選擇波長630 nm，在紫外分光光度儀下測定光密度(A)值，以不加GdCl3作為空白對照，并以預(yù)先建立的標(biāo)準(zhǔn)GdCl3濃度曲線為基礎(chǔ)計(jì)算出游離Gd3+濃度，Gd-DOTA-hTERT ASON的結(jié)合率(%)= (反應(yīng)液Gd3+總濃度－游離Gd3+濃度)/游離Gd3+濃度×100%。

1.2.3 標(biāo)記探針的體外實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性檢測

將標(biāo)記好的探針加入新鮮人血清并在37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的溫箱中培養(yǎng)，分別于1、2、4、8、12、24 h檢測探針的標(biāo)記率。

1.2.4 細(xì)胞學(xué)攝取實(shí)驗(yàn)及體外MR顯像

人黑色素瘤A375細(xì)胞及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)分別由四川大學(xué)華西醫(yī)院核醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室和再生醫(yī)學(xué)中心惠贈。細(xì)胞培養(yǎng)于含L-谷氨酸(2.0 mmol/L)、碳酸氫鈉(1.5 ng/L)、非必需氨基酸(0.1 mmol/L)、丙酮酸鈉(1.2 mmol/L)、10%小牛血清(體積分?jǐn)?shù))、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀況，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)評價(jià)細(xì)胞活力。99mTc-DOTA-ASON的制備及質(zhì)控參照朱高紅等［13］所報(bào)道的方法，本實(shí)驗(yàn)所使用的99mTc-DOTA-ASON標(biāo)記率和放射化學(xué)純度分別為75.56%和94.48%。

取對數(shù)生長期細(xì)胞，以106/孔種植于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入20 μL99mTc-DOTA-ASON(37 MBq/mL)/ Gd-DOTA-hTERT ASON (10 μg/mL)/Gd-DTPA (10 μmol/mL)和200 μL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0.5、1、2、4、6 h終止培養(yǎng)，并進(jìn)行如下處理：將含有分子探針的培養(yǎng)基收集于1支試管中，標(biāo)記為剩余管，然后以PBS液洗滌3次，并將洗滌液移入剩余管中，在γ放射免疫計(jì)數(shù)上測定計(jì)數(shù)(Crest)；用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞移入另一試管中，標(biāo)記為攝取管，用PBS洗滌3次，將洗滌液收集于攝取管中，測定計(jì)數(shù)(Cuptake)；細(xì)胞攝取率(%)=Cuptake/(Crest＋Cuptake)×100%；將Gd-DOTA-hTERT ASON和Gd-DTPA組細(xì)胞收集并懸浮于EP管中，在7.0 T MRI下行常規(guī)T1WI掃描，以ROI技術(shù)，記錄各管的信號強(qiáng)度(signal intensity，SI)。

1.2.5 腫瘤模型的建立

實(shí)驗(yàn)動物：BALB/c裸鼠，4～6周齡，18～20 g，雌性。飼養(yǎng)于四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心無特定病原體(SPF)環(huán)境中，所用飼料、飲水與墊料均經(jīng)高壓滅菌處理，實(shí)驗(yàn)所有操作均在超凈工作臺進(jìn)行。取對數(shù)生長期黑色素瘤A375細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，離心洗滌2次，用無血清DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，用1 mL注射器接種于裸鼠右側(cè)臀部皮下，各注射0.2 mL (約含5×106個(gè)腫瘤細(xì)胞)。待腫瘤直徑達(dá)8～10 mm時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 探針的生物分布

取荷黑色素瘤A375裸鼠，并分為7組，每組5只，通過尾靜脈分別注射99mTc- DOTA-ASON 7.4 MBq(0.2 mL)，分別于注射后0.5、1、2、4、8、12、24 h各處死1組，取血、主要臟器及腫瘤組織，用0.9%NS洗滌2次，用吸水紙吸干后稱體質(zhì)量并測量放射性計(jì)數(shù)，經(jīng)物理衰變校正后計(jì)算每克組織百分注射劑量率(%ID/g)。

1.2.7 體內(nèi)MR顯像

取15只荷瘤小鼠，分成3組，實(shí)驗(yàn)組：通過腹腔分別注射Gd- DOTA-ASON 0.2 mL (10 μg/mL)；正義寡核苷酸(sense oligonucleotide，SON)對照組：注射相同劑量Gd-DOTA-SON；Gd-DTPA對照組：注射0.2 mL Gd- DTPA(10 μmol/mL，GE Health Care)。分別于注射后0.5、1、2、4、6、8、12 h行7.0T Micro-MRI(Bruker Biospec，Germany)，使用1%～2%異氟烷(isoflurane，

所有計(jì)量資料均經(jīng)SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，結(jié)果以x±s表示，均數(shù)間的比較用one-way ANOVA和New Student t-test。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Hebei，China)吸入麻醉動物，5 cm內(nèi)徑表面線圈，動物取俯臥位，成像參數(shù)：多層面多回波T1加權(quán)序列(MSME-T1)，TR：561 ms，TE：14 ms，層厚1 mm，Matix：256×256。利用感興趣區(qū)(ROI)技術(shù)，計(jì)算腫瘤與鄰近軟組織的信噪比(SNR)，圖像處理用ParaVision 5.0軟件。

1.2.8 病理組織學(xué)檢測

體外實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞爬片法直接進(jìn)行端粒酶免疫組織化學(xué)染色，體內(nèi)顯像完成后48 h，將動物處死，取腫瘤及鄰近組織用4%甲醛溶液固定48 h后用石蠟包埋，制成5 μm厚的切片，進(jìn)行端粒酶免疫組織化學(xué)染色，檢測端粒酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 反義探針的標(biāo)記和體外穩(wěn)定性

Gd-DOTA-ASON的標(biāo)記率可達(dá)65%(63.2±2.4，n=6)，在室溫下及37 ℃0.9%NaCl溶液中和新鮮人血清中24 h內(nèi)Gd-DOTA-ASON標(biāo)記率下降＜2%(圖1)。

圖 1 Gd- DOTA-ASON在不同條件下的穩(wěn)定性曲線Fig. 1 The stability of Gd- DOTA-ASON under different conditions

2.2 細(xì)胞學(xué)攝取和體外MRI

A375細(xì)胞對反義探針的最高攝取率為(8.9±0.3)%，明顯高于HUVEC(5.7±0.4)%(P=0.002，n=6)，高峰時(shí)間為4 h且可被DOTA-ASON明顯抑制(3.6±0.4)%(P＜0.05，n=6)。MRI細(xì)胞顯像結(jié)果顯示，Gd-DOTA-ASON細(xì)胞信號明顯高于DOTA-ASON和Gd-DTPA組，表明Gd- DOTAASON反義探針可被細(xì)胞攝取(圖2)。

圖 2 Gd-DOTA-ASON 體外MRI成像Fig. 2 In vitro MR images of Gd-DOTA-ASON (upper line), Gd-DOTA-SON (Middle) and Gd-DTPA (lower line) treated A375 cells

2.3 反義探針的生物分布

99mTc-DOTA-ASON在荷A375腫瘤小鼠體內(nèi)分布結(jié)果(表1)顯示，注射后0.5 h腫瘤內(nèi)反義探針計(jì)數(shù)相對較高，隨即開始下降，于4 h重新達(dá)到最高值(2.18±0.29)%ID/g并在12 h內(nèi)保持在較高水平；反義探針主要通過腎臟排泄，部分經(jīng)腸道排泄，血液清除較快，骨骼、肺、肌肉、脾等非靶器官攝取較少。

2.4 體內(nèi)MR顯像

在注射Gd- DTPA 和Gd- DOTA-ASON/SON后2 h內(nèi)，腫瘤均出現(xiàn)明顯強(qiáng)化(圖3)。Gd-DTPA組腫瘤在注射后6 h其信號強(qiáng)度明顯降低與注射前相近，而反義探針組則持續(xù)強(qiáng)化；ROI分析結(jié)果顯示，Gd-DTPA組腫瘤SNR高峰時(shí)間出現(xiàn)在注射后0.5 h，隨即開始下降，到6 h接近1.0，而反義探針在0.5 h出現(xiàn)峰值后，有所下降，于2 h又重新出現(xiàn)峰值并在6 h內(nèi)維持在較高水平，正義探針組SNR波動規(guī)律與反義探針組相似，但其在2、4、6 h的SNR明顯低于反義探針組(P＜0.05，n=5)；注射后0.5 h 3組腫瘤的SNR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，n=5)，但在2、4、6 h的SNR明顯低于反義探針組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的SNR (P＜0.05，n=5，圖4)。

2.5 病理學(xué)分析

細(xì)胞爬片法免疫組織化學(xué)染色顯示A375細(xì)胞端粒酶染色呈陽性，但可被Gd- DOTAASON/99mTc-DOTA-ASON所抑制，此結(jié)果提示反義探針可被細(xì)胞攝取并與端粒酶RNA模板相結(jié)合，抑制端粒酶的表達(dá)(圖5)。

組織切片法免疫組化結(jié)果進(jìn)一步表明，反義探針在體內(nèi)也可被A375腫瘤細(xì)胞所攝取，并可抑制腫瘤端粒酶的表達(dá)，而Gd-DTPA組端粒酶則呈強(qiáng)陽性(圖6)。

表 199mTc-DOTA-ASON 在荷A375腫瘤裸鼠體內(nèi)的生物分布Tab. 1 Biodistribution (%ID/g) of99mTc-DOTA-ASON in mice bearing A375 Xenografts

圖 3 腹膜腔注射不同MRI顯像劑前后，荷A375腫瘤裸鼠模型多層面多回波T1加權(quán)序列MRI成像Fig. 3 MSME-T1weighted MR images of nude mice bearing A375 tumor at pre-injection and 0.5, 2, 6 h after intraperitoneal injection

圖 4 注射后不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤與鄰近軟組織的信噪比Fig. 4 SNR of tumors to muscle after peritoneal injection of Gd-DOTA-ASON/SON and Gd-DTPA at different time point

圖 5 不同方法處理后的A375細(xì)胞hTERT 免疫組織化學(xué)染色Fig. 5 Immunohistostaining of hTERT of A375 cells

圖 6 A375腫瘤組織hTERT 免疫組織化學(xué)染色Fig. 6 Immunohistostaining of hTERT of A375 tumor

3 討 論

端粒酶作為惡性腫瘤重要的標(biāo)志物之一，在惡性腫瘤的診斷與治療領(lǐng)域中起著至關(guān)重要的作用［14-16］，Liu等［17］首次利用99mTc -MAG3-hTERT ASON實(shí)現(xiàn)了對人端粒酶活性進(jìn)行核醫(yī)學(xué)顯像，但放射核素反義顯像［17-19］雖具有靈敏度高、掃描時(shí)間短、探針用量少等優(yōu)點(diǎn)，但也存在著解剖和空間分辨低等不足，本研究合成的99mTc-DOTA-hTERT ASON反義探針標(biāo)記率、放射化學(xué)純度及生物分布與Liu等［17］報(bào)道的相似；本實(shí)驗(yàn)所使Gd-DOTA-hTERT ASON探針對A375腫瘤進(jìn)行MRI靶向成像，在圖像空間、解剖及軟組織分辨率方面明顯顯示了MRI影像的優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)所制備的Gd-DOTA-hTERT ASON在標(biāo)記率、體內(nèi)外穩(wěn)定性方面較Derek等［12］報(bào)道稍高，可能是因?yàn)镾iRNA分子結(jié)構(gòu)不同，且未予以化學(xué)修飾有關(guān)，但仍需進(jìn)一步的研究。此外，在生物分布中，骨骼，肌肉、胃腸等器官或組織中對反義探針也有非特異性攝取或分布，其原因可能與細(xì)胞對反義探針的非特異性攝取機(jī)制有關(guān)［20］。細(xì)胞爬片及腫瘤組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果提示，在反義探針處理組中，A375細(xì)胞的hTERT活性均比非反義探針處理組低，此結(jié)果提示反義探針進(jìn)入細(xì)胞后與細(xì)胞的hTERT正義寡核苷酸(SON)發(fā)生了雜交反應(yīng)，并可能在一定程度上抑制了hTERT的表達(dá)［17］。

傳統(tǒng)的MRI對比劑主要是細(xì)胞外對比劑，其所形成的信號差異主要與病變部位的血供相關(guān)，因此，對于貧血供的惡性腫瘤或富血供的良性腫瘤的診斷方面胞外對比劑也難免會誤診或漏診，本實(shí)驗(yàn)所制備的反義探針從注射后30 min內(nèi)生物分布及SNR結(jié)果可以與血液灌注有關(guān)，此結(jié)果與Liu等［17］報(bào)道一致。本實(shí)驗(yàn)體外及體內(nèi)MRI顯像表明，Gd-DOTA-ASON可作為一種腫瘤特異性對比劑，且在顯像時(shí)可不受時(shí)間和腫瘤血供的限制。此外，病理檢測結(jié)果提示，本反義探針在體內(nèi)外均對腫瘤端粒酶有一定的抑制作用，因此將探針標(biāo)記上治療性放射性核素(如188Re，89Sr等)后，有望為腫瘤治療提供一種新方法。

雖然85%以上的腫瘤以表達(dá)端粒酶活性的方式來維持端粒的穩(wěn)定，但仍有10%～15%的惡性腫瘤以變換端粒長度的方式(ALT)保持端粒長度［21］，對于此類型的腫瘤診斷和治療則是本探針目前尚未解決的問題，但可通過惡性腫瘤的其他生物學(xué)特征制備相應(yīng)的分子探針以進(jìn)行靶向診斷與治療。此外，以Gd3+為基礎(chǔ)的探針另一不足之處是無法通過特異的染色方法來顯示其在細(xì)胞內(nèi)的位置［21-22］，但以超順磁性氧化鐵(SPIO)為基礎(chǔ)的納米顆粒探針則可解決此問題［23-24］。盡管如此，本研究為MRI腫瘤靶向顯像提供了一種新的方法，而進(jìn)一步研究方向?yàn)橐苑戳x探針為基礎(chǔ)的原位腫瘤模型的靶向顯像與治療。

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歡迎訂閱2013年《循證醫(yī)學(xué)》雜志

《循證醫(yī)學(xué)》是經(jīng)國家新聞出版署批準(zhǔn)，廣東省衛(wèi)生廳主管，由廣東省循證醫(yī)學(xué)科研中心、廣東省人民醫(yī)院和中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院主辦的醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)期刊。現(xiàn)為“中國科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊（中國科技核心期刊）”，《CNKI中國期刊全文數(shù)據(jù)庫》、“萬方數(shù)據(jù) — 數(shù)字化期刊群”全文收錄期刊，“中國學(xué)術(shù)期刊綜合評價(jià)數(shù)據(jù)庫”統(tǒng)計(jì)源期刊，《中國科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫》、《中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫》、《中國核心期刊（遴選）數(shù)據(jù)庫》、《中文生物醫(yī)學(xué)期刊文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫》、《中文科技期刊數(shù)據(jù)庫》來源期刊，榮獲首屆《CAJ-CD規(guī)范》執(zhí)行優(yōu)秀期刊獎(jiǎng)。

主編吳一龍（廣東省人民醫(yī)院副院長、廣東省人民醫(yī)院腫瘤中心主任、廣東省肺癌研究所所長、廣東省循證醫(yī)學(xué)科研中心主任，中山大學(xué)、南方醫(yī)科大學(xué)、汕頭大學(xué)、廣東省心血管病研究所腫瘤學(xué)教授，博士生導(dǎo)師）。本刊以廣大醫(yī)藥衛(wèi)生技術(shù)人員和醫(yī)療、教學(xué)、科研管理工作者為讀者對象，立足臨床醫(yī)學(xué)，介紹循證醫(yī)學(xué)（evidence-based medicine , EBM）的理念、方法及相關(guān)知識，探討符合中國國情的循證醫(yī)學(xué)實(shí)踐，促進(jìn)國內(nèi)外醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)交流和醫(yī)學(xué)科學(xué)發(fā)展。

本刊以臨床實(shí)踐指導(dǎo)性為特色，設(shè)置的主要欄目有：先睹為快、述評、特別報(bào)告、循證評價(jià)、論著（包括診斷性研究、療效研究、病因?qū)W研究、疾病的預(yù)后研究等）、證據(jù)的尋求與評價(jià)、循證醫(yī)學(xué)中的醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)問題、循證醫(yī)學(xué)理論與方法研究、綜述與講座、教育與爭鳴、循證醫(yī)學(xué)在線、循證病例討論、臨床指引與共識等。誠摯歡迎投稿。

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《循證醫(yī)學(xué)編輯部》

An experimental research of magnetic resonance tumor targeting imaging with Gd labeled human telomerase reverse transcriptase antisense oligonucleotide (Gd-DOTA-hTERT ASON)

ZHU Gaohong1, REN Bing-xiu1, WEI Jiang-liang1, SU Yu-lin1, HE Rui1, ZHANG Wei3, CAI Jing1, SONG Bin2(1.Department of Nuclear Medicine, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming Yunnan 650032, China; 2.Department of Radiology, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu Sichuan 610041, China; 3.Department of Radiology, Tumor Hospital of Sichuan Province, Chengdu Sichuan 610043, China)

REN Bing-xiu E-mail: yn76ren@126.com

Background and purpose: Researches had indicated that about over 85% of malignant tumors highly express telomerase activity. So telomerase has become one of the important methods in the research field of tumor diagnosis and treatment. Nowadays, several reports about malignant tumor which over expresses hTERTtargeting imaging with radionuclide labeled hTERT ASON had been published. In these reports, high quality of pictures can hardly be acquired because of poor anatomical and spacial resolution in nuclear imaging itself. Accordingly, in this study, we developed a method of detecting human telomerase in vivo with magnetic resonance imaging (MRI) and evaluate its feasibility. Methods: Firstly, Uniformly phosphorothioate-modified human telomerase reverse transcriptase antisense oligonucleotide (hTERT ASON) was labeled with Gd3+through the bifunctional chelator 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-N, N’, N’’, N’’’-tetraacetic acid (DOTA) and iv vitro experiments were performed to characterize the antisense probes (for biodistribution and cellular uptake,99mTc-DOTA-ASON was used in stead of Gd-DOTA-ASON). Then Gd-DOTA-ASON was injected intraperitoneally in pulmonary adenocarcinoma A375 nude mice tumor-bearing BALB/c for in vivo imaging using 7.0 T Micro MRI periodically, tumors and their surrounding tissues were defined as region of interest (ROI) to calculate the signal to noise ratio (SNR) of tumor to muscle using Gd-DTPA as control. Finally, immunohistochemical analysis of telomerase activity of each xenograft was operated 2 days after imaging. Results: The binding efficiency of Gd-DOTA-ASON reached was as high as 65% (63.2±2.4, n=6). And it can maintain 61% in fresh human serum and normal saline at 37 ℃ over 24 h; A375 cells showed an uptake of 8.5% when incubated with 99mTc -DOTA-ASON; In comparing with DOTA-ASON and Gd-DTPA, cells transected with Gd-DOTA-ASON had higher SI when performed MRI with T1WI. The hTERT-expressing xenografts were obviously enhanced by Gd-DOTA-ASON at 0.5–6 h after injection and the SNR can reach 2.37, whereas obvious enhancement only could be found within 2 h after injection of Gd-DTPA. Both labeled and non-labeled antisense probes can suppress the activity of telomerase of A375 cells either in vitro or in vitro. Conclusion: Our research offers proof that Gd-DOTAASON can be used as tumor specific targeting MR probe for diagnosing malignant tumors with high expression of telomerase.

Antisense probe; Telomerase; MRI; Tumor; DOTA

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.10.007

R73-3

：A

：1007-3639(2013)10-0821-08

2012-10-30

2013-09-18）

任炳秀 E-mail:yn76ren@126.com