三七總皂苷對(duì)腦出血大鼠凝血酶及神經(jīng)功能的影響

趙雪松陳志剛高 芳徐枝芳

（1北京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院東方醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京，100078；2日本昭和大學(xué)醫(yī)學(xué)部顯微解剖教室，日本，142-8555）

三七總皂苷對(duì)腦出血大鼠凝血酶及神經(jīng)功能的影響

趙雪松1陳志剛1高 芳1徐枝芳2

（1北京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院東方醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京，100078；2日本昭和大學(xué)醫(yī)學(xué)部顯微解剖教室，日本，142-8555）

目的：研究三七總皂苷對(duì)腦出血大鼠凝血酶及神經(jīng)功能影響。方法：SD雄性大鼠200只隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、用藥組，每組又有6 h，24 h，48 h，72 h，7天5個(gè)時(shí)間點(diǎn)?？瞻捉M每組5只，其余每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只大鼠。采用尾殼核注入膠原酶肝素生理鹽水溶液法建立大鼠腦出血模型，治療組給予三七總皂苷腹腔注射，每天一次。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，采用改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分（Modified neurological severity score，mNSS）對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模后各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果：各時(shí)間點(diǎn)模型組mNSS和空白組假手術(shù)組比，明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P＜0.05），除6 h外，各時(shí)間點(diǎn)模型組和用藥組比，用藥組mNSS明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。測(cè)定纖維蛋白原含量和纖維蛋白原凝血時(shí)間，纖維蛋白原含量和纖維蛋白原凝血時(shí)間48 h模型組和用藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：腦出血模型組中，6 h開(kāi)始，mNSS明顯增高，到48 h達(dá)到高峰，以后逐漸下降，三七總皂苷可以明顯下調(diào)mNSS評(píng)分。纖維蛋白原含量和纖維蛋白原凝血時(shí)間在模型組升高，用藥組下降，說(shuō)明三七發(fā)揮了發(fā)揮了活血行淤作用。

腦出血；三七總皂苷；凝血酶；mNSS

腦出血（Intracerebral Hemorrhage，ICH）是最危重的一種卒中類(lèi)型，占所有卒中事件10%～25%［1］。ICH的病死率明顯高于缺血性卒中，直接病死率為38%～43%，病殘率為70%～80%［2］，其復(fù)發(fā)率約為1.8%～11%［3］。ICH具有發(fā)病急、變化快、病情危重、病機(jī)復(fù)雜等特點(diǎn)，臨床必須緊急救治，故急性期救治對(duì)提高搶救成功率和患者的生存質(zhì)量具有重要意義。目前關(guān)于ICH急性期的治療無(wú)突破性的進(jìn)展，尤其是內(nèi)科治療，多限于脫水降顱壓、調(diào)整血壓、改善營(yíng)養(yǎng)代謝和防治并發(fā)癥等對(duì)癥及支持療法，缺乏針對(duì)性強(qiáng)、有效的治療手段，多數(shù)ICH患者都留下神經(jīng)功能缺損。ICH后腦損傷的機(jī)制很多，包括血腫的擴(kuò)大、血腫周?chē)M織缺血（缺血性半暗帶）、血腫周?chē)M織腦水腫等［4］，在血腫形成過(guò)程中和形成后，都存在腦水腫，在腦水腫發(fā)生機(jī)制中，凝血酶的作用受到了廣泛關(guān)注。它是凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的基本成分，腦出血后迅速生成。腦水腫和凝血酶都具有神經(jīng)毒性，破壞神經(jīng)的正常功能，本研究通過(guò)三七總皂苷對(duì)腦出血大鼠凝血酶及神經(jīng)功能評(píng)分的影響，探討其對(duì)腦出血的治療作用。

1 資料與方法

1.1 試劑與動(dòng)物模型的制備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SD雄性大鼠，體重230～250 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。大鼠隨機(jī)分為空白組，假手術(shù)組，模型組，用藥組四個(gè)組，每組又分為6 h，24 h，48 h，72 h，7天5個(gè)時(shí)間點(diǎn)。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只大鼠。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑 立體定位儀（日本stoelting公司），Ⅳ型膠原酶（sigma公司，貨號(hào)C-5138），三七總皂苷（廣西梧州制藥集團(tuán)股份有限公司），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司，DHG-9145A型），離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5810R）。微量進(jìn)樣器（上海安亭器械廠(chǎng)）。

1.1.3 動(dòng)物模型制作與給藥 腦出血模型制備參考Rosenberg等的方法。以10%水合氯醛（0.4 mg／100 g）腹腔麻醉。俯臥固定大鼠于動(dòng)物頭顱立體定位儀，頭皮丁字切開(kāi)，取前囟為原點(diǎn)，向右3 mm、向后1 mm、深度5.5 mm為注射點(diǎn)（尾殼核），骨鉆鉆開(kāi)顱骨，進(jìn)針后緩慢注射藥物溶液，留針5 min，緩慢退針。切口撒適量青霉素鉀粉，縫合皮膚后回籠飼養(yǎng)?？瞻讓?duì)照組不做任何處理，普通飼養(yǎng)，自動(dòng)飲水。假手術(shù)組顱內(nèi)注入2μL滅菌生理鹽水，普通飼養(yǎng)，腹腔注射生理鹽水（1 mL／100 g）。模型組注射膠原酶／肝素鈉／生理鹽水溶液2.0μL（每1μL溶液含Ⅳ型膠原酶0.2 U及肝素2 U），普通飼養(yǎng)，腹腔注射生理鹽水（1 mL／100 g）。用藥組造模同模型組，腹腔注射三七總皂苷注射液（血栓通粉針150 mg／支）7.2 mg／100 g，于造模后立即給藥1次，之后每24 h給藥1次。三七總皂苷注射液配置，150 mg溶入15 mL生理鹽水中，溶液中含10 g／mL血栓通針?lè)?，?00 g體重給藥0.72 m L。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 mNSS評(píng)定神經(jīng)功能 將每組各時(shí)間點(diǎn)大鼠在在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)做mNSS評(píng)分，mNSS，改良神經(jīng)功能評(píng)分，是目前國(guó)際上公認(rèn)的大鼠腦卒中后神經(jīng)功能缺失評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，主要包括提尾反射、行走測(cè)試、感覺(jué)測(cè)試、平衡測(cè)試、反射缺失和反常運(yùn)動(dòng)。最大得分為18分，缺少一項(xiàng)反射或動(dòng)物不能完成一項(xiàng)任務(wù)給1分，輕型傷：1～6分，中型傷：7～12分，重型傷：13～18分，具體如下。提尾反射（正常0分，最大3分）前肢屈曲1分；后肢屈曲1分；頭上抬距垂直軸＞100，且維持在30 s之內(nèi)1分。行走測(cè)試（正常0分，最大3分）正常行走0分；不能走直線(xiàn)1分；向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈2分；向偏癱側(cè)傾倒3分。感覺(jué)測(cè)試（正常0分，最大2分）視覺(jué)和觸覺(jué)測(cè)試1分；深感覺(jué)測(cè)試（拉爪子加強(qiáng)肌肉收縮）1分。

平衡測(cè)試（正常0分，最大6分）平衡良好0分；抓住平衡木的邊緣1分；懸蕩并且一只爪子掉下來(lái)2分；懸蕩并且兩只爪子掉下來(lái)或者在平衡木上旋轉(zhuǎn)（＞60 s）3分；試圖在平衡木上保持平衡但失?。ǎ?0 s）4分；試圖在平衡木上保持平衡但失?。ǎ?0 s）5分；掉下來(lái)，沒(méi)有試圖在平衡木上保持平衡6分。

反射缺失和反常運(yùn)動(dòng)（正常0分，最大4分）耳廓反射（當(dāng)耳廓被觸動(dòng)時(shí)，頭晃動(dòng)）1分；角膜反射（當(dāng)用棉花輕觸角膜時(shí)，眼睛眨動(dòng)）1分；驚嚇?lè)瓷洌ㄔ胍粢鸬倪\(yùn)動(dòng)反應(yīng)）1分；抓握、肌陣攣、肌張力障礙1分。最大得分18分。

1.2.2 取血及凝血酶測(cè)定 將每組各時(shí)間點(diǎn)大鼠在在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)麻醉，剪開(kāi)腹腔，分離出腹主動(dòng)脈，用一次性采血針和枸櫞酸鈉抗凝管采血，采出血后，上下緩慢混勻，然后迅速插入冰里，準(zhǔn)備離心，離心條件是40C3000轉(zhuǎn)離心10 min，取上清分裝備用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mNSS評(píng)分測(cè)定 空白組由于沒(méi)有干預(yù)，所以沒(méi)有神經(jīng)功能障礙，假手術(shù)組注射生理鹽水對(duì)大鼠腦組織有損傷，動(dòng)物干預(yù)后會(huì)存在短時(shí)的神經(jīng)功能障礙，24 h時(shí)神經(jīng)功能恢復(fù)正常；腦出血組神經(jīng)功能評(píng)分較高，在48 h時(shí)神經(jīng)功能缺失最重，同假手術(shù)組相比，有明顯差異（P＜0.05）；治療組運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、平衡以及反射四個(gè)方面缺失程度減輕，mNSS神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于腦出血組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 腦出血三七總皂苷治療后mNSS評(píng)分的變化（）

表1 腦出血三七總皂苷治療后mNSS評(píng)分的變化（）

6 h 24 h 48 h 72 h 7 d空白對(duì)照組組別0±0 0±0 0±0 0±0 0±0假手術(shù)組1.50±0.71 0.3±0.48 0±0 0±0 0±0模型組6.30±0.95 10.0±1.25 12.5±1.51 12.0±0.67 8.30±0.67用藥組5.90±0.74*8.10±0.74*10.9±0.86*9.5±0.71*5.70±0.82*P 0.247 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 三七總皂苷治療后血漿中FIB和FIBs的變化（）

表2 三七總皂苷治療后血漿中FIB和FIBs的變化（）

注：模型組和用藥組相比，*P＜0.05。

組別只數(shù)FIB（g／L）FIBs（s ）假手術(shù)組3.65±0.85 5.17±0.95模型組3 5.40±0.84*3.63±0.51*用藥組3 3.17±0.81*5.87±1.25*P 3 0.017 0.028

2.2 凝血酶測(cè)定 取48 h血漿測(cè)凝血酶相關(guān)指標(biāo)，選取纖維蛋白原含量（FIB）和纖維蛋白原凝血時(shí)間（FIBs）兩個(gè)指標(biāo)檢測(cè)。見(jiàn)表2。

3 討論

ICH后腦損傷的機(jī)制很多，包括血腫的擴(kuò)大、血腫周?chē)M織缺血（缺血性半暗帶）、血腫周?chē)M織腦水腫、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧自由基和補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)等［4］，各種機(jī)制之間又存在千絲萬(wàn)縷的關(guān)聯(lián)。ICH后最初的損傷是由血腫擴(kuò)大導(dǎo)致機(jī)械性壓力所造成的；在血腫形成過(guò)程中和形成后，都存在水腫，造成了對(duì)腦組織的進(jìn)一步損傷［4］。在腦水腫發(fā)生機(jī)制中，凝血酶的作用受到了廣泛關(guān)注。它是凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的基本成分，腦出血后迅速生成。早期水腫的形成牽涉到凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活和凝血酶的產(chǎn)生，后期則主要是凝血酶引起的血腦屏障（Blood brain barrier，BBB）破壞所致的血源性水腫。凝血酶是一種血清絲氨酸蛋白酶，由無(wú)活性的凝血酶原產(chǎn)生，催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白。凝血酶神經(jīng)作用機(jī)制較為復(fù)雜，凝血酶［5］參與凝血，引起血小板聚集分泌、血栓素的形成和平滑肌收縮；凝血酶與內(nèi)皮細(xì)胞快速結(jié)合，刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放血小板活化因子、內(nèi)皮素、前列腺素和內(nèi)皮源性松弛因子。在腦出血后除參與凝血外，還是一種重要的神經(jīng)毒性遞質(zhì)，它能引起腦水腫，破壞血腦屏障和產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，引起神經(jīng)元損傷。vaughan等人［6］研究發(fā)現(xiàn)小劑量凝血酶產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，大劑量則具有細(xì)胞毒性作用。當(dāng)出血破入大腦后，主要由外源性凝血途徑產(chǎn)生大劑量凝血酶，持續(xù)直至凝血酶原耗盡，依次激活產(chǎn)生腦水腫的途徑［7］。凝血酶對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用以及對(duì)血腦屏障的損傷可能是腦出血后腦水腫加重的重要機(jī)制。凝血酶本身和凝血過(guò)程中產(chǎn)生的一系列物質(zhì)及腦水腫是引起腦損傷和神經(jīng)功能缺損的重要因素。

ICH屬中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為，中風(fēng)皆由內(nèi)因所致，是在氣血陰陽(yáng)失調(diào)基礎(chǔ)上，風(fēng)、火、痰、瘀等多種因素共同作用于人體，導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)，氣血逆亂于腦部而發(fā)生的。其病位在腦，病性多為本虛標(biāo)實(shí)、上盛下虛。腦出血后機(jī)體發(fā)生復(fù)雜的病理機(jī)制，“離經(jīng)之血即為瘀”，出血性中風(fēng)屬“離經(jīng)之血，瘀于腦府”，以絡(luò)破血瘀貫穿發(fā)病全過(guò)程。發(fā)病之初，腦絡(luò)損而血溢，離經(jīng)之血為瘀血，血行不暢，損傷腦絡(luò)、腦髓，進(jìn)一步加重了出血和血瘀。一定程度上，“瘀血”病機(jī)與凝血、炎性反應(yīng)、腦水腫、組織缺血等病理機(jī)制是相吻合的。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)影像呈現(xiàn)異常密度影，表明出血性中風(fēng)為“惡血留內(nèi)”，治療應(yīng)以活血化瘀為第一要義，瘀血是痰、熱、毒的源頭，故需澄其源。

三七具有“止血不留瘀”的特點(diǎn)，三七的活性成分三七總皂苷，研究表明可改善血腫周?chē)⒀h(huán)、降低血腦屏障通透性、清除自由基、減輕腦水腫以治療出血性中風(fēng)。故選擇與凝血及腦水腫密切相關(guān)且之間又相互關(guān)聯(lián)的凝血因子為切入點(diǎn)，進(jìn)行活血化瘀法治療腦出血模型作用機(jī)制的研究。三七作為活血化瘀法的代表藥物，具化瘀止血，活血定痛之功效，止血且不留瘀，適用于ICH血腫形成、繼發(fā)缺血及局部代謝障礙等形成的瘀血癥，其主要有效成分為三七總皂苷。三七總皂苷針劑成分較單一，已長(zhǎng)期運(yùn)用于臨床，作為本次活血化瘀的研究藥物，以探討ICH用藥后對(duì)腦出血大鼠凝血酶及神經(jīng)缺損評(píng)分的影響。實(shí)驗(yàn)研究表明，三七總皂苷可以改善腦出血周?chē)X組織凝血酶的表達(dá)從而起到腦保護(hù)作用，可以改善神經(jīng)缺損起到腦保護(hù)作用，為活血化瘀藥物用于治療腦出血提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并進(jìn)一步探討腦組織保護(hù)作用的機(jī)制。

本研究表明，大鼠腦出血模型制作后，6 h開(kāi)始，mNSS評(píng)分明顯升高，到48 h達(dá)到高峰，以后逐漸下降。三七總皂苷腹腔給藥后，6 h組作用不明顯，可能與藥物作用時(shí)間段有關(guān)系，其余時(shí)間點(diǎn)，給藥后mNSS評(píng)分明顯下降，說(shuō)明三七總皂苷對(duì)于減輕大鼠腦出血后神經(jīng)功能缺損是有效的，為臨床活血化瘀藥治療腦出血提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。纖維蛋白原含量在用藥后下降，纖維蛋白原凝血時(shí)間在用藥后變長(zhǎng)，說(shuō)明血液中纖維蛋白原減少，三七發(fā)揮了活血行淤的作用，為臨床用活血化瘀法治療腦出血提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（2013-06-21收稿）

Im pact of Panax Notoginseng Saponins on the Cerebral Edema of Rats w ith Coagulation Cascade Pathway via Neurologic Im pairment

Zhao Xuesong1，Chen Zhigang1，Gao Fang1，Xu Zhifang2
（1 Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China；2 Department of Anatomy，Showa University，School of Medicine，Tokyo，Japan，142-8555）

Objective：To investigate the effects of Panax notoginseng saponins（PNS）on the cerebral edema and thrombin in the rats with cerebral hemorrhage（ICH）.M ethods：In present study，200 SD rats were randomly divided into 4 groups：blank control，sham control，model and PNS treatmentgroups.ICH was induced by stereotactic injection of the collagenaseⅣinto the right caudate nucleus. PNSor saline was injected intraperitoneally once a day after ICH，and the neurologic impairmentwas assessed by nMSSmethod for 5 time points：6 h，24 h，48 hour，72 h and 7 d.Both content of serous fibrinogen（FIB）and Fibrinogen clotting time（FIBs）were measured.Results：The score ofmNSS increased from 6h（P＜0.05）following ICH，and peaked at 48h，then returned to the normal on the 7th day，and the PNS decreased cerebral water content significantly at every examined time points except for 6 h（P＜0.05）. Moreover，both serous FIB and FIBs increased obviously at48 h after ICH（P＜0.05）.The PNS inhibited the increase of both content compared with that inmodel group（FIB P＝0.017，TT P＝0.028）.Conclusion：In rats，the score ofmNSSstarted from 6h following ICH with a peak at 48 hours，and then decreased gradually，accompanied by the elevation of FIB and FIBs at48h.PNS can effectively alleviate the score ofmNSS via the inhibition of coagulation cascade pathway.

Cerebral hemorrhage（ICH）；Panax Notoginseng Saponins（PNS）；Thrombin；mNSS

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.11.024

北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題項(xiàng)目資助項(xiàng)目（編號(hào)：2013-JYBZZ-XS-154）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金（新教師類(lèi)）資助課題（編號(hào)：2011001312001）；北京中醫(yī)藥大學(xué)科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（編號(hào)：2011-CXTD-23）

陳志剛，男，北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，郵編：100078；Tel：010-67689776