血脂康對肥胖相關(guān)性腎病大鼠脂聯(lián)素、炎癥因子及尿蛋白的影響

馬文玲 浙江中醫(yī)藥大學 杭州 310053

趙 湘 沈曉剛 沈 維 姚 炯 浙江省人民醫(yī)院

·論 著·

血脂康對肥胖相關(guān)性腎病大鼠脂聯(lián)素、炎癥因子及尿蛋白的影響

馬文玲 浙江中醫(yī)藥大學 杭州 310053

趙 湘 沈曉剛 沈 維 姚 炯 浙江省人民醫(yī)院

目的：觀察血脂康對肥胖相關(guān)性腎?。∣RG）大鼠脂聯(lián)素、炎癥因子及尿蛋白的影響，探討血脂康對ORG大鼠腎臟保護作用機制。方法：雄性Wistar大鼠30只，隨機分為正常組、模型組和血脂康組，每組10只，分別給予普通飼料、高脂飼料、高脂飼料+血脂康喂養(yǎng)12周，觀察各組大鼠血清脂聯(lián)素、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、24h尿蛋白水平及腎臟病理變化。結(jié)果：12周后，模型組大鼠血清脂聯(lián)素水平降低，IL-6水平升高，尿蛋白排泄增加，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01），TNF-α水平雖有升高，但與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），腎臟病理損害明顯。血脂康組脂聯(lián)素水平升高，IL-6水平下降，尿蛋白減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01），腎臟病理損害減輕。結(jié)論：血脂康可下調(diào)肥胖相關(guān)性腎病大鼠炎癥因子IL-6表達，升高抗炎因子脂聯(lián)素水平，減輕炎癥反應，從而發(fā)揮腎臟保護作用。

大鼠 肥胖相關(guān)性腎病 脂聯(lián)素 炎癥因子 血脂康

肥胖作為一種特殊的病理生理狀態(tài)，通過一系列代謝機制及血流動力學導致腎臟損害，炎癥因子及細胞因子的參與在其中起重要作用。脂聯(lián)素是由脂肪組織分泌的細胞因子，不僅與肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病有關(guān)，還具有抗炎、抗動脈粥樣硬化等作用。肥胖患者血漿中促炎細胞因子如白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）等增加，抗炎細胞因子脂聯(lián)素水平降低[1-3]。本研究通過觀察血脂康對肥胖相關(guān)性腎?。╫besity related glomerulopathy，ORG）大鼠脂聯(lián)素、IL-6、TNF-α水平、尿蛋白及腎臟病理的影響，探討其對腎臟的保護作用機制。

1 實驗材料

1.1動 物 雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量（150± 10g），浙江中醫(yī)藥大學動物中心提供 [許可證號：SCXK（滬）2008-0016]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物中心，單籠飼養(yǎng)，每籠5只，環(huán)境溫度（20±2）℃，濕度55%～65%，自由攝食、飲水。普通飼料由南京安立默科技有限公司提供；高脂飼料（配方：普通飼料70.75g、蛋黃粉10g、豬油8g、白沙糖10g、膽固醇1g、膽酸鈉0.25g）由浙江省醫(yī)學科學院提供。

1.2藥物及試劑 血脂康膠囊（批號20090801，規(guī)格：每粒0.3g，北京北大維信生物科技有限公司，參照文獻[4]換算大鼠每天所需劑量為240mg/kg，臨用時以生理鹽水溶解，濃度24mg/mL）。IL-6、TNF-α、脂聯(lián)素試劑盒（Lot：20100711，美國R&D Systems公司），Elx50洗板機和Elx800酶標儀（美國BIO-TEK公司），AU5400生化儀以及原裝試劑盒（日本Olympus公司），石蠟切片機（LEICA 35，德國），顯微鏡攝像機（OLYMPUS BX20型，日本），BMJⅢ型包埋機及冷凍臺（中國江蘇），GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（中國上海），透射電鏡（Hitachi型號H7650，日本）。

2 實驗方法

2.1分組及造模 大鼠適應性飼養(yǎng)7天后，隨機分為正常對照組、模型組和血脂康組，每組10只。正常組喂養(yǎng)普通飼料，同時予生理鹽水灌胃；模型組喂養(yǎng)高脂飼料，同時予生理鹽水灌胃；血脂康組喂養(yǎng)高脂飼料，并予血脂康混懸液（根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量，并不固定，例如體質(zhì)量200mg大鼠，每天灌胃2mL，300mg大鼠每天灌胃3mL）灌胃，每天1次；每周稱重，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量，共飼養(yǎng)12周。

2.2觀察指標

2.2.1大體觀察 包括精神狀態(tài)、體質(zhì)量、體長、大小便、食欲及毛發(fā)光亮度等。記錄大鼠體質(zhì)量及體長，計算Lee’s指數(shù)=體質(zhì)量（g）1/3×103/體長(cm)。

2.2.224h尿蛋白測定 12周末，將大鼠置于代謝籠內(nèi)，禁食不禁水24h，留取24h尿液，全自動生化分析儀測定24h尿蛋白（mg/24h）。

2.2.3脂聯(lián)素、IL-6及TNF-α測定 10%的水合氯醛腹腔麻醉，經(jīng)腹主動脈取血，分離血清，采用ELISA法測定脂聯(lián)素、IL-6及TNF-α含量。

2.3腎臟組織病理學檢查

2.3.1光鏡觀察 12周末處死大鼠，將左右腎臟去包膜稱重。腎組織常規(guī)處理后，經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)、過碘酸雪夫（PAS）染色，光鏡下觀察腎小球病變。PAS染色切片數(shù)碼相機拍攝圖像（×200），隨機選取含血管極和（或）尿極的最大腎小球區(qū)域拍攝圖像，用Image-Pro Plus 5.0圖像系統(tǒng)測量該腎小球相互垂直的兩個最大直徑，每張組織切片至少檢測5個腎小球，取平均值。

2.3.2超微結(jié)構(gòu)觀察 每只大鼠腎組織進行電鏡包埋，1μm超薄切片染色后電鏡下觀察2～3個腎小球，在1 5000倍電子顯微鏡下拍攝腎小球基底膜（GBM），每個腎小球拍攝2～3張照片，掃描入計算機后，用Image-Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)，以電鏡照片給定的標尺為標準，測量GBM厚度。

2.4統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1一般情況 正常組大鼠表現(xiàn)為體質(zhì)量自然增加，反應靈敏，活動敏捷，毛發(fā)密集而有光澤，緊貼皮膚，鼻、唇濕潤清潔，眼睛明亮。模型組大鼠形體肥胖，行動緩慢，反應遲鈍，毛發(fā)干枯、蓬松且易脫落。血脂康組行為表現(xiàn)、體質(zhì)量和營養(yǎng)狀況等方面與模型組相比有一定改善。

3.2各組大鼠體質(zhì)量、體長、Lee’s指數(shù)及24h尿蛋白水平比較 飼養(yǎng)至12周時模型組大鼠比正常組平均體質(zhì)量增高約20.84%，符合大鼠肥胖標準[5]。12周末，模型組大鼠體質(zhì)量、體長、Lee's指數(shù)及24h尿蛋白較正常組明顯增加（P均＜0.01）；與模型組比較，血脂康組大鼠體質(zhì)量、體長及Lee’s指數(shù)降低，24h尿蛋白排泄減少，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01），見表1。

3.3各組脂聯(lián)素、IL-6、TNF-α水平比較 與正常組比較，模型組IL-6水平明顯升高（P＜0.01），脂聯(lián)素水平降低（P＜0.01），TNF-α水平雖有升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，血脂康組脂聯(lián)素水平升高（P＜0.01），IL-6水平降低（P＜0.01），TNF-α水平雖有降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、體長、Lee's指數(shù)及24h尿蛋白水平比較（）

表1 各組大鼠體質(zhì)量、體長、Lee's指數(shù)及24h尿蛋白水平比較（）

注：與正常組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.01

組別正常組模型組血脂康組n/只10 10 10體質(zhì)量/g 343.10±8.67 414.60±9.62△350.54±1.70*體長/cm 21.86±0.39 22.52±0.38△21.95±0.06* Lee's指數(shù)320.32±4.47 331.13±3.73△321.29±0.50*尿蛋白/（mg/24h）3.66±0.23 4.53±0.79△3.67±0.07*

表2 各組脂聯(lián)素、IL-6、TNF-α水平比較（）

表2 各組脂聯(lián)素、IL-6、TNF-α水平比較（）

注：與正常組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.01

3.4腎臟病理觀察 光鏡下模型組腎小球體積增大，腎小球細胞數(shù)目增多，系膜區(qū)輕度增寬，可見系膜細胞增生，系膜基質(zhì)少量增多，毛細血管擴張充血。腎小管上皮細胞腫脹變性，部分間質(zhì)可見炎性細胞浸潤。用Image-Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)，測量模型組腎小球內(nèi)徑增加，較正常組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），血脂康組腎小球內(nèi)徑較模型組減?。≒＜0.05），見表3，圖1～3（封二）。電鏡下正常組腎小球基底膜未見明顯增厚，細胞足突形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；模型組腎小球基底膜較正常組顯著增厚（P＜0.01），足突明顯融合，“窗孔”部分消失。血脂康組足突未見明顯融合，腎小球基底膜厚度與模型組比較降低明顯（P＜0.01），見表3，圖4～6（封二）。

表3 各組大鼠腎小球內(nèi)徑、腎小球基底膜比較（）

表3 各組大鼠腎小球內(nèi)徑、腎小球基底膜比較（）

注：與正常組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.01

10 10 10正常組模型組血脂康組119.53±3.39 134.19±7.35△121.48±2.01* 140.72±3.69 288.66±13.41△161.15±14.68*

4 討論

肥胖被認為是一種慢性低度炎癥，1974年Weisinger等首次報道嚴重肥胖可導致大量蛋白尿。1975年Cohen首先提出肥胖相關(guān)性腎小球疾?。∣RG），是一種以肥胖、蛋白尿、不伴水腫和血白蛋白正常為特點的臨床綜合征，主要病理特點為腎小球肥大和局灶性節(jié)段性腎小球硬化。肥胖導致腎損傷的作用機制主要有腎素血管緊張素系統(tǒng)的激活、血流動力學的改變、脂質(zhì)代謝紊亂及炎癥因子的參與等[6]。肥胖患者血漿中炎癥因子增加，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、C反應蛋白（CRP）、抵抗素等，抗炎因子如脂聯(lián)素等減少。

IL-6可增加內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞黏附分子的表達，激活局部RAS（renin-angiotensin system，RAS）系統(tǒng)，引起細胞損傷；同時可增加轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表達而促進腎臟纖維化。TNF-α與其受體的結(jié)合可導致巨噬細胞浸潤，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription fator-κB，NF-κB）及TGF-β1表達上調(diào)，從而引起腎臟上皮細胞、系膜細胞和內(nèi)皮細胞的損害[7]。曹競文等[8]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可促進脂肪細胞中IL-6 mRNA的表達，并呈時間依賴性抑制脂聯(lián)素mRNA及PPAR-γmRNA表達，而PPAR-γ是脂聯(lián)素最主要的轉(zhuǎn)錄因子。TNF-α可通過NF-κB依賴的機制減少klotho表達而引起腎臟損傷[9]。

脂聯(lián)素是由脂肪組織分泌的特異性血漿蛋白。動物實驗及臨床研究均提示脂聯(lián)素與肥胖、胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、2型糖尿病、動脈粥樣硬化、代謝綜合征等都有一定相關(guān)性。研究顯示，肥胖患者血漿脂聯(lián)素水平明顯降低，體質(zhì)量下降后脂聯(lián)素水平上升，提示可能存在一種負反饋機制下調(diào)了脂肪細胞對脂聯(lián)素的表達分泌。脂聯(lián)素可抑制NF-κB的活性，減少脂肪細胞中IL-6、TNF-α的分泌，增加脂肪細胞PPAR-γ2的表達，從而抑制炎癥反應[10]。體外試驗發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可逆轉(zhuǎn)TNF-α介導的外周單核細胞黏附所致的內(nèi)皮細胞損傷，從而抑制炎癥引起的血管損傷[11]。Sharma等[12]研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素可減少脂聯(lián)素基因敲除小鼠的尿蛋白，且對足細胞有保護作用。脂聯(lián)素可抑制系膜細胞中高糖誘導的活性氧自由基的產(chǎn)生，促進內(nèi)皮一氧化氮合酶的產(chǎn)生，從而對系膜細胞內(nèi)起保護作用[13]。肥胖患者脂肪細胞增多，炎癥因子如IL-6、TNF-α等分泌增多，脂聯(lián)素水平下降，兩者相互作用，加劇炎癥反應，加重細胞損傷。

血脂康是由中藥紅曲精煉而成的天然他汀類藥物，主要成分為洛伐他汀，還含有多種不飽和脂肪酸和必需氨基酸。他汀類降脂藥可調(diào)節(jié)和保護血管內(nèi)皮細胞功能，直接抑制腎小球系膜細胞增殖，抑制細胞外基質(zhì)及炎性因子的分泌，減少腎小球硬化的發(fā)生；還可直接抑制近端腎小管上皮細胞由受體介導的對白蛋白的內(nèi)吞重吸收作用，減少腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[14-15]。研究[16]發(fā)現(xiàn)，紅曲中洛伐他汀的溶解速度及口服生物利用度高于洛伐他汀片劑，提示紅曲藥用效果更好，而紅曲提取物血脂康的作用有過之而無不及。在非酒精性脂肪肝和高脂血癥患者中，血脂康可顯著降低血清TNF-α及IL-6水平，提示血脂康有抗炎作用[17]。

本實驗中，模型組大鼠表現(xiàn)為體質(zhì)量增加，尿蛋白增加，腎臟病理改變明顯，提示肥胖相關(guān)性腎病大鼠模型復制成功。模型組大鼠炎癥因子IL-6水平明顯增加（P＜0.01），TNF-α雖有增加，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），抗炎因子脂聯(lián)素水平下降（P＜0.01）。血脂康組IL-6明顯低于模型組（P＜0.01），脂聯(lián)素水平升高（P＜0.01），尿蛋白減少，腎臟病理損害減輕，提示血脂康可能通過降低炎癥因子水平，增加抗炎因子水平，減輕炎癥反應而對肥胖相關(guān)性腎病大鼠起到腎臟保護作用。

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Effects of Xuezhikang on Adiponectin，Inflammatory Cytokines and Proteinuria in Obesity-Related Glomerulopathy Rats

MA Wenling，ZHAO Xiang，SHEN Xiaogang，etal.Zhejiang ChineseMedicalUniversity，Hangzhou（310053），China

Objective：To observe the effects of Xuezhikang on adiponectin,inflammatory cytokines,and 24 h urinary protein in obesity-related glomerulopathy（ORG）rats，in order to investigate the renal protective mechanism of Xuezhikang on ORG rats.Methods：Thirty male Wistar rats were randomly divided into normal group，model group，and Xuezhikang group，10 rats in each group.Normal group was fed on normal diet，model group was fed on high fat diet，and Xuezhikang group was fed with both high fat diet and Xuezhikang，totally for 12 weeks.The followings were observed：serum adiponectin，interleukin-6（IL-6），tumor necrosis factor-α（TNF-α），24 h urinary protein，and renal pathological alterations.Results：After 12 weeks，compared with the normal group，the model rats'serum adiponectin reduced，and IL-6 and 24 h urinary protein increased，all with statistically significant differences（P＜0.01），but TNF-α elevated without a significant difference between the two groups（P＞0.05）；and the alteration of renal pathology in the model group was more tremendous than that in the normal group.Compared with the model group，Xuezhikang group had higher adiponectin,lower IL-6 and 24 h urinary protein（P＜0.01），and renal pathological damage mitigated.Conclusion：Xueazhikang may play a renal protective effect on ORG rats by downregulating the expression of inflammatory cytokines such as IL-6，and increasing anti-inflammatory cytokines levels like adiponectin.

rats obesity related glomerulopathy adiponectin inflammtary cytokines Xuezhikang

2013-03-05

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No：2009CA048）

趙湘，Tel：13335885196；E-mail：13335885196@163.com