HAK基因?qū)τ衩椎倪z傳轉(zhuǎn)化及其耐鹽性研究

季 靜，汪婷婷，王 罡，吳 疆，關(guān)春峰

(1. 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2. 天津大學(xué)遺傳工程研究所，天津 300072)

HAK基因?qū)τ衩椎倪z傳轉(zhuǎn)化及其耐鹽性研究

季 靜1,2，汪婷婷1,2，王 罡2，吳 疆1，關(guān)春峰2

(1. 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2. 天津大學(xué)遺傳工程研究所，天津 300072)

用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因(HAK)和Bar基因轉(zhuǎn)入5個優(yōu)良玉米自交系7922、P138、265、238和271中，并對影響其遺傳轉(zhuǎn)化效率因素進(jìn)行了優(yōu)化．經(jīng)PCR和RT-PCR檢測證實(shí)獲得陽性植株．除草劑涂抹實(shí)驗(yàn)證明Bar基因已經(jīng)整合進(jìn)玉米基因組．用不同濃度的鹽溶液處理轉(zhuǎn)基因植株和對照植株，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株葉片中的K+含量、脯氨酸和葉綠素含量均高于未轉(zhuǎn)化植株，而Na+含量低于未轉(zhuǎn)化植株，表明HAK基因已經(jīng)整合進(jìn)玉米基因組，并通過過量表達(dá)提高了植株的耐鹽性．

玉米自交系；農(nóng)桿菌介導(dǎo)；HAK；耐鹽性

玉米是世界上重要的糧食作物和工業(yè)原料之一，因此玉米的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)一直是各國科學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)．目前，將外源基因轉(zhuǎn)入玉米的方法主要有2種：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和基因槍法[1]．相對于其他轉(zhuǎn)化法來說，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法具有能完整轉(zhuǎn)化較大的DNA片段、外源基因拷貝數(shù)少、整合位點(diǎn)比較穩(wěn)定且不需要進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)等優(yōu)勢[2]，已成為植物基因工程中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)．雖然這項(xiàng)技術(shù)已被成功應(yīng)用于30多種雙子葉植物的轉(zhuǎn)化，但是單子葉植物特別是像玉米、水稻、小麥等這些重要的農(nóng)作物卻一直被排除在農(nóng)桿菌的天然宿主范圍之外．因此，農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米的遺傳轉(zhuǎn)化經(jīng)過了一段很長的摸索時期．20世紀(jì)90年代以后，玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了迅猛發(fā)展．1991年，Gould等[3]用帶有GUS和NPT Ⅱ基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米芽尖分生組織獲得成功．1999年，國內(nèi)黃璐等[4]首次用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米Ⅱ型胚性愈傷組織并獲得了再生植株．由于玉米不是農(nóng)桿菌的天然宿主，其轉(zhuǎn)化效率受到多種因素影響，因此如何建立穩(wěn)定、高效且易于再生的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是玉米轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵．

鉀離子是植物體內(nèi)大量元素中含量最為豐富的，對植物的生長發(fā)育起著非常重要的作用，如作為酶的活化劑，參與植物的蛋白質(zhì)合成、氮代謝、脂肪代謝、滲透調(diào)節(jié)、氣孔的開閉[5]，維持細(xì)胞內(nèi)電荷平衡和細(xì)胞膜功能，促進(jìn)植物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，以及增強(qiáng)植物抗逆性等[6-7]．作為植物體內(nèi)的主要營養(yǎng)元素，鉀離子的含量占到植物細(xì)胞干重的0.8%～8.0%，在植物細(xì)胞內(nèi)鉀離子含量維持在80～200,mmol/L[8]. Ashley等[9]研究發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)鉀離子的獲得只能來源于土壤．大部分土壤中雖然全鉀含量很高，但可供植物有效吸收的鉀離子含量卻很少．隨著我國作物單產(chǎn)量的提高，土壤缺鉀的問題日益嚴(yán)重．因此，培育高效鉀吸收的作物品種或通過基因工程方法改良植物的鉀營養(yǎng)性狀已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[10]．

高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因(high affinity K+transporter，HAK)是高親和K+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體基因KUP /HAK/KT家族中的一員，該家族在植物的鉀營養(yǎng)吸收方面起著非常重要的作用．HAK基因的表達(dá)能使植物在低鉀及鹽脅迫條件下提高對K+的吸收能力，維持正常的K+濃度和生理功能，保持高K+/Na+，從而提高植物的耐鹽性[11]．馮書陽[12]將HAK基因轉(zhuǎn)入煙草中，發(fā)現(xiàn)該基因在煙草中能正常表達(dá)，轉(zhuǎn)化后的煙草具有一定的抗鹽性．但該基因目前在玉米上的遺傳轉(zhuǎn)化尚未見報道，因此筆者將HAK基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入優(yōu)良玉米自交系來提高玉米營養(yǎng)品質(zhì)，并在鹽脅迫條件下測定玉米生理指標(biāo)，為獲得耐鹽新品種提供理論依據(jù)．

1 材料和方法

1.1 植物材料

優(yōu)良玉米自交系7922、P138、265、238和271的植株在人工授粉后10～15,d后，取其1.0～1.5,mm幼胚接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4～5周得到П型胚性愈傷組織，每14,d繼代一次，取長勢較好的П型胚性愈傷組織作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體材料．

1.2 菌株和質(zhì)粒

農(nóng)桿菌菌株為EHA105，攜帶雙元質(zhì)粒pCAMBIA3300，如圖1所示．質(zhì)粒pCAMBIA3300的T-DNA區(qū)含有高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(HAK)和乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(Bar)．

圖1 pCAMBIA3300-35S-HAK質(zhì)粒圖譜Fig.1 Schematic representation of plasmid pCAMBIA3300-35S-HAK

1.3 培養(yǎng)基

研究采用了3種基本誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MB(MS大量和B5微量)、NM(N6大量和MS微量)和NB(N6大量和B5微量)，其基本成分如表1所示．

表1 實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)Tab.1 Medium formulation for experiment

1.4 最高篩選壓力的確定

將自交系7922未轉(zhuǎn)化的胚性愈傷組織分別接入含有0、2,mg/L、4,mg/L、6,mg/L、8,mg/L、10,mg/L除草劑(PPT)的繼代培養(yǎng)基上．15,d后觀察胚性愈傷組織褐化情況，統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織的褐變率，再將存活的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基，30,d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織出苗率，根據(jù)愈傷組織的褐變率和出苗率，確定最適宜的篩選壓力．

1.5 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

1.5.1 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)

從平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于YEP液體培養(yǎng)基(含100,mg/L卡那霉素)中，28,℃、180,r/min振蕩培養(yǎng)過夜，當(dāng)農(nóng)桿菌生長至對數(shù)生長期(OD600不同)時，20,℃、4,000,r/min離心10,min收集菌體，用等體積侵染培養(yǎng)基重懸菌體．

1.5.2 外植體的轉(zhuǎn)化及篩選

挑取長勢良好的玉米胚性愈傷組織，切成3,mm左右的小塊，浸泡于含有100,μmol/L乙酰丁香酮(AS)的重懸液中，不停振蕩．侵染5～20,min后棄去菌液，用濾紙吸干愈傷組織表面的菌液后，放入共培培養(yǎng)基中22,℃暗培養(yǎng)3,d．將愈傷組織轉(zhuǎn)入延遲培養(yǎng)基28,℃暗培養(yǎng)7,d后轉(zhuǎn)入篩選Ⅰ培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，再轉(zhuǎn)入篩選Ⅱ培養(yǎng)基中篩選2次，每次2周．將獲得的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入再生Ⅰ培養(yǎng)基中25,℃暗培養(yǎng)3周．待體胚變白、腫脹時移入再生Ⅱ培養(yǎng)基中25,℃光照培養(yǎng)分化出苗．待小苗長出3～4片葉子，煉苗后移入花盆放于溫室培養(yǎng)．

1.6 分子檢測

1.6.1 DNA的提取

采用CTAB法提取DNA．

1.6.2 PCR檢測

PCR反應(yīng)體系為25,μL，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4,℃4,min；94,℃ 30,s，55,℃ 30,s，72,℃ 2.5,min，30個循環(huán)；72,℃延伸8,min．產(chǎn)物經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測．引物如下．

上游：ATGTCGCTCGAGGTCGAGAAC．下游：CTATATTTCATATGTGATCCCAAC．

1.6.3 RT-PCR檢測

用對照植株和轉(zhuǎn)基因植株提取葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模板[13]，用HAK基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出的片段大小為502,bp．?dāng)U增反應(yīng)程序?yàn)椋?4,℃ 4,min；94,℃ 30,s，55,℃ 30,s，72,℃40,s，30個循環(huán)；72,℃延伸8,min．產(chǎn)物經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測．引物如下．

上游：TATGCGAACGACAATGGA．

下游：GGTTGAAAGCCCGTAAAA．

1.7 轉(zhuǎn)基因植株除草劑抗性實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)基因植株種子播種于花盆中，待T1代植株長出5片葉子時，將PPT質(zhì)量濃度為200,mg/L的農(nóng)藥涂抹在轉(zhuǎn)基因植株和對照植株的葉片上，7,d后觀察葉片壞死情況．

1.8 轉(zhuǎn)基因植株的生理指標(biāo)檢測

選取未轉(zhuǎn)化植株和3個T1代轉(zhuǎn)基因株系Z-1、Z-2、Z-3，分別用含0、100,mmol/L、200,mmol/L的NaCl的1/2,MS營養(yǎng)液處理植株，每3,d澆一次，處理2周后，取樣測定葉片中K+、Na+、脯氨酸、葉綠素含量．葉片分別用濃H2SO4和H2O2消煮后，用火焰光度計(jì)測量K+、Na+含量[14]，采用茚三酮法測定脯氨酸含量[15]，葉綠素含量測定參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行．進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)．

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對玉米愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

將7922、P138、265、238和271授粉10～15,d后的幼胚分別接種于MB、NM、NB培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果如表2所示．通過分析發(fā)現(xiàn)，這3種培養(yǎng)基對5個自交系玉米的愈傷組織誘導(dǎo)率都很高，但是Ⅱ型胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率卻有明顯差異：MB培養(yǎng)基胚性愈傷組織誘導(dǎo)率顯著低于NM、NB培養(yǎng)基(見表2)，誘導(dǎo)出的愈傷組織多呈水漬狀，易褐化；NM次之；誘導(dǎo)率最高的是NB培養(yǎng)基，且誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織成淺黃色，質(zhì)地松脆．

表2 培養(yǎng)基對玉米幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率的影響Tab.2 Effect of medium on maize embryogenic callus induction ratio

2.2 幼胚大小對玉米愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

取7922和P138授粉10～15,d后，大小在0.5～2.5,mm之間的幼胚接種在NB培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2周以后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，結(jié)果如圖2所示．對于同一自交系的玉米，不同幼胚大小愈傷組織誘導(dǎo)率有顯著差異．幼胚大小在1.0～1.5,mm時愈傷組織誘導(dǎo)率最高，7922為91.5%，P138為85.4%．對于不同玉米自交系相同大小的幼胚，其愈傷組織誘導(dǎo)率也有所差異.

圖2 幼胚大小對玉米愈傷組織誘導(dǎo)率的影響Fig.2 Effect of the size of immature embryos on maize embryogenic callus induction ratio

2.3 最高篩選壓力的確定

將7922未轉(zhuǎn)化的胚性愈傷組織接入含有不同質(zhì)量濃度PPT的繼代培養(yǎng)基上，2周后觀察愈傷組織的褐化情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3．結(jié)果表明，隨著PPT質(zhì)量濃度的增大，愈傷組織的褐化率增大，出苗率降低．當(dāng)PPT質(zhì)量濃度為4,mg/L時，愈傷組織的褐化率接近50%；當(dāng)PPT質(zhì)量濃度為10,mg/L時，愈傷組織已經(jīng)全部褐化死亡．當(dāng)PPT質(zhì)量濃度大于6,mg/L時，愈傷組織的分化能力被強(qiáng)烈抑制，由于篩選劑在2次篩選過程中有累加毒害作用，故將5,mg/L定為篩選劑的最高質(zhì)量濃度．

表3 篩選劑PPT適宜質(zhì)量濃度的確定Tab.3 Selection of suitable PPT concentration

2.4 菌液濃度及侵染時間對轉(zhuǎn)化率的影響

取長勢良好的7922Ⅱ型胚性愈傷組織，用菌液濃度OD600分別為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0的EHA105的菌液分別侵染5,min、10,min、15,min和20,min，統(tǒng)計(jì)抗性愈傷組織獲得率，見圖3．結(jié)果表明當(dāng)OD600為0.6、侵染時間為15,min時，抗性愈傷組織獲得率最高為32.7%；當(dāng)OD600較大、侵染時間較長時，抗性愈傷組織的獲得率反而下降，這可能是因?yàn)檗r(nóng)桿菌的過量生長對愈傷組織造成了更為嚴(yán)重的傷害，而且加大了后期抑菌的難度．本實(shí)驗(yàn)確立了最佳的侵染條件為在OD600為0.6時侵染15,min．

圖3 菌液濃度和侵染時間對抗性愈傷率的影響Fig.3Effect of A.tumefaciens concentration and infection time on maize resistant callus ratio

2.5 共培養(yǎng)溫度對轉(zhuǎn)化率的影響

較低的共培養(yǎng)溫度能促進(jìn)農(nóng)桿菌對植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化．Salas等[17]研究了溫度對T-DNA在植物細(xì)胞內(nèi)整合的影響，認(rèn)為雖然19,℃是T-DNA轉(zhuǎn)移的最佳溫度，但在25,℃時植物細(xì)胞對農(nóng)桿菌的敏感度和T-DNA的整合的穩(wěn)定性是最好的．因此本實(shí)驗(yàn)選取了中間溫度，研究了在22,℃和27,℃下共培養(yǎng)溫度對玉米轉(zhuǎn)化效率的影響，發(fā)現(xiàn)在22,℃共培養(yǎng)條件下獲得的抗性愈傷率明顯高于27,℃的共培養(yǎng)條件，22,℃時農(nóng)桿菌生長速度較為緩慢，這有利于后期對農(nóng)桿菌的抑制．

2.6 分子檢測

本實(shí)驗(yàn)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法對5個玉米自交系進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，共轉(zhuǎn)化684個胚性愈傷組織．經(jīng)PPT篩選后獲得的抗性愈傷組織在再生培養(yǎng)基上分化出苗，共獲得114株抗性植株(見表4)．經(jīng)PCR檢測，得到14株陽性植株，共3個自交系(見圖4)．對3個轉(zhuǎn)基因品系的T1代植株進(jìn)行的PCR檢測和RT-PCR檢測(見圖5)，證明HAK基因已經(jīng)整合進(jìn)玉米基因組，并能正常轉(zhuǎn)錄．

表4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米自交系的轉(zhuǎn)化效率Tab.4 Efficiency of Agrobacterium-mediated transformation of maize inbred lines

圖4 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測Fig.4 PCR assay of transformed plants

圖5 T1代轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR檢測Fig.5 RT-PCR assay of T1 transformed plants

2.7 轉(zhuǎn)基因植株除草劑抗性實(shí)驗(yàn)

用PPT質(zhì)量濃度為200,mg/L的農(nóng)藥涂抹在T1代轉(zhuǎn)基因植株和對照植株的葉片上，一周后非轉(zhuǎn)基因植株葉片出現(xiàn)了明顯的變黃枯萎，而轉(zhuǎn)基因植株葉片變化較小，少數(shù)有輕微的褪綠現(xiàn)象發(fā)生，如圖6所示．這初步說明Bar基因也同時整合進(jìn)玉米基因組中并一定程度上得到了表達(dá)．

圖6 轉(zhuǎn)基因植株和對照植株葉片對除草劑抗性檢測Fig.6 PPT resistance test in leaves of nontransformed plant and transformed plant

2.8 轉(zhuǎn)基因植株的生理檢測

2.8.1 轉(zhuǎn)基因植株葉片中K+、Na+含量測定

在鹽脅迫條件下，隨著NaCl濃度逐漸升高，玉米葉片中的K+含量逐漸降低(見圖7(a))，Na+含量逐漸升高(見圖7(b))．但轉(zhuǎn)基因植株葉片中K+含量明顯高于未轉(zhuǎn)化植株，而對Na+的攝入量則少于未轉(zhuǎn)化植株．相對于未轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)基因植株維持了較高的K+/Na+含量比(見圖7(c))．這說明轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下對K+選擇吸收性大，能維持高K+/Na+含量比，更好地保證植株的正常生長．

圖7 轉(zhuǎn)基因植株和對照植株葉片中K+、Na+及K+/Na+含量測定Fig.7K+，Na+and K+/Na+content in leaves of nontransformed plants and transformed plants

2.8.2 轉(zhuǎn)基因植株葉片中脯氨酸和葉綠素含量測定

脯氨酸是一種有機(jī)小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)．如圖8(a)所示，在鹽脅迫條件下，非轉(zhuǎn)化植株和轉(zhuǎn)基因植株葉片中脯氨酸含量都有所增加，且隨著鹽濃度的增大，游離脯氨酸的含量也增大，這說明脯氨酸的積累能增強(qiáng)植物的抗逆性．在200,mmol/L NaCl條件下，轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的游離脯氨酸含量分別比未轉(zhuǎn)化植株提高了67.29%、51.64%和61.70%，對高鹽表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性．

鹽脅迫條件下，植物體內(nèi)水分缺失，光合作用受到影響，葉片中葉綠素含量降低．如圖8(b)所示，在鹽處理?xiàng)l件下，雖然轉(zhuǎn)基因植株葉片中葉綠素含量整體呈下降趨勢，但與未轉(zhuǎn)化植株相比，其葉綠素含量明顯高于未轉(zhuǎn)化植株，受到的影響較小，維持了較好的生理狀態(tài)．

圖8 轉(zhuǎn)基因植株和對照植株葉片中脯氨酸和葉綠素含量測定Fig.8 Proline and total chlorophyll content in leaves of nontransformed plants and transformed plants

3 討 論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化中，不同生長階段及不同生理狀態(tài)的植物細(xì)胞對農(nóng)桿菌的敏感程度不同．幼胚因其容易誘導(dǎo)出Ⅱ型胚性愈傷組織、再生頻率高且轉(zhuǎn)化率較為理想而成為首選，且Ⅱ型胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率受到玉米基因型、幼胚大小、培養(yǎng)基條件等多種因素的影響[18-19]．本實(shí)驗(yàn)即以幼胚誘導(dǎo)產(chǎn)生的Ⅱ型胚性愈傷組織為材料進(jìn)行侵染，并對上述影響因素進(jìn)行了研究．

研究表明，農(nóng)桿菌侵染過程中，農(nóng)桿菌菌株及菌液濃度、侵染時間和共培養(yǎng)時間及溫度等因子對農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率起著至關(guān)重要的作用[20-21]．本實(shí)驗(yàn)對農(nóng)桿菌濃度、侵染時間及共培養(yǎng)溫度進(jìn)行了優(yōu)化，并確定了最高篩選壓5,mg/L PPT，但再生后的植株存在陽性率較低的問題，這可能和篩選壓力較低有關(guān)，然而，當(dāng)篩選壓較高時會嚴(yán)重抑制愈傷組織的分化，適當(dāng)?shù)暮Y選體系需要進(jìn)一步的探究．

鹽脅迫對植物造成的傷害主要包括離子毒害、細(xì)胞膜通透性改變、滲透壓改變及對光合作用的影響[22]. 本實(shí)驗(yàn)研究了NaCl造成的鹽漬環(huán)境對轉(zhuǎn)基因植株生理活性的影響，測定了鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株葉片中K+、Na+、脯氨酸和葉綠素含量．K+/Na+是植株耐鹽性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，植物在受脅迫時體內(nèi)的脯氨酸含量會大量積累，光合作用也會因?yàn)槟そY(jié)構(gòu)遭到破壞而受到影響，葉綠素含量降低．本實(shí)驗(yàn)中在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株葉片中K+、K+/Na+、脯氨酸和葉綠素含量明顯高于未轉(zhuǎn)化植株，而Na+含量低于未轉(zhuǎn)化植株，說明HAK基因的表達(dá)使轉(zhuǎn)基因植株在高鹽條件下能有效地吸收K+，保持高的K+/Na+，減少了鹽分對植株的傷害，增強(qiáng)了植株的耐鹽性．

4 結(jié) 語

研究結(jié)果表明，大小為1.0～1.5,mm的幼胚在NB培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)時，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高．轉(zhuǎn)化的最適條件為農(nóng)桿菌OD600為0.6時侵染15,min，22,℃暗培養(yǎng)3,d．經(jīng)過以上條件的優(yōu)化，獲得了具有較強(qiáng)耐鹽性的轉(zhuǎn)基因陽性植株，證明了本體系的可行性.

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Genetic Transformation of Maize with HAK Gene and Its Effect on Salt Tolerance

Ji Jing1,2，Wang Tingting1,2，Wang Gang2，Wu Jiang1，Guan Chunfeng2
(1. School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2. Research Institute of Genetic Engineering，Tianjin University，Tianjin 300072，China)

The HAK and Bar genes were transferred into five different inbred lines of maize，including 7922，P138，265，238 and 271，by Agrobacterium-mediated transformation. Factors influencing transformation efficiency were optimized. Transgenic plants, which are resistant to phosphinothricin (PPT), were acquired by PCR and RT-PCR. When treated with different concentration of NaCl, higer K+，proline and chlorophyll contents were observed in transgenic leaves than in wild type leaves，but Na+content in transgenic leaves was obviously lower than in wild type leaves. These results show that HAK gene is integrated into maize genome and transcribed normally. Over-expressing of HAK gene enhances the salt tolerance of transgenic maize.

maize inbred line；Agrobacterium-mediated；HAK；salt tolerance

Q943

A

0493-2137(2013)07-0659-07

DOI 10.11784/tdxb20130715

2011-12-10；

2012-03-28.

國家轉(zhuǎn)基因生命新品種培育重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2009ZX08003-019B)；國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2011ZX08003-005)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31271793，31271419)；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(20100032110060)．

季 靜（1965— ），女，博士，教授，jijingtjdx@163.com.

王 罡，wanggangtjdx@126.com.