TRAIL誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤LN215細(xì)胞凋亡抵抗的機(jī)制

張艷春 于洪泉 王 猛 趙東海 金 宏 齊 玲 劉興吉

(吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院麻醉科，吉林 吉林 132013)

惡性膠質(zhì)瘤目前尚缺乏理想的治療方法〔1〕。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)作為一種新型的抗腫瘤藥物，在美國(guó)已進(jìn)入臨床Ⅱ期實(shí)驗(yàn)階段〔2〕。但大部分惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡發(fā)生抵抗〔3〕，其機(jī)制仍然不清。本文對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN215細(xì)胞和單克隆細(xì)胞進(jìn)行研究，為TRAIL作為腫瘤治療新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 重組人TRAIL(rhTRAIL)(Peprotech公司);DMEM/F12培養(yǎng)基、小牛血清(Gibco公司);對(duì)硝基苯(上海生物工程技術(shù)公司);兔抗人第二個(gè)線粒體激活因子(SMAC)多克隆抗體(Biomol公司);兔抗人BH3結(jié)構(gòu)域凋亡誘導(dǎo)蛋白(BID)多克隆抗體(Invitrogen公司);兔抗人肌動(dòng)蛋白(actin)多克隆抗體(Sigma公司);過(guò)氧化物酶標(biāo)記IgG第二抗體(Jackson Immunoresearch公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分離單克隆細(xì)胞 將LN215細(xì)胞接種于含10%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合至80%～90%，用0.25%胰酶消化，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)后稀釋。按1～2個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為5%CO2，37℃孵箱。每天觀察生長(zhǎng)情況，標(biāo)記出含單個(gè)細(xì)胞的孔。待其匯合，轉(zhuǎn)入24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。每周換液2次，90%匯合后轉(zhuǎn)入65 mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 酸性磷酸酶法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的百分率 待細(xì)胞融合至85%，0.25%胰酶消化，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞后，以1×104個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞分為11組，加入TRAIL(0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10，30，100，300 ng/ml)，對(duì)照組使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基。24 h后小心棄上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去培養(yǎng)基，每孔加入酸性磷酸酶底物檢測(cè)液(對(duì)硝基苯新鮮配制)100μl，繼續(xù)培養(yǎng)90 min，加入終止液，室溫下孵育5 min。酶標(biāo)儀405 nm處測(cè)定各孔光吸收值。按照公式計(jì)算細(xì)胞凋亡率=(1-藥物組光吸收值/對(duì)照組光吸收值)×100%。

1.4 Western印跡法檢測(cè)蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞，3 000 r/min離心后棄上清。PBS洗滌細(xì)胞離心后棄上清，每個(gè)管中加入50μl細(xì)胞裂解液，12 000 r/min 4℃ 離心 15 min，棄去沉淀，Braford測(cè)定法檢測(cè)樣品蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離樣品，4℃轉(zhuǎn)膜封閉，加入一抗4℃過(guò)夜。加入二抗，室溫、避光孵育1 h，膠片曝光拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 LN215細(xì)胞及單克隆細(xì)胞的培養(yǎng) 惡性膠質(zhì)瘤LN215細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后培養(yǎng)，細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形，有的可見(jiàn)明顯的突起。觀察96孔板內(nèi)含單細(xì)胞孔細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)發(fā)現(xiàn):雖然細(xì)胞來(lái)自于同一株細(xì)胞，但各單克隆細(xì)胞生長(zhǎng)速度不同、形態(tài)也不全相同。待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%時(shí)，挑選出生長(zhǎng)速度與形態(tài)均不相同的32株細(xì)胞，用胰酶消化轉(zhuǎn)入24孔板生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。比較后發(fā)現(xiàn)有5株單克隆細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)、生長(zhǎng)速度不同，編號(hào)分別是1、6、17、13和32。這5株細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 LN215細(xì)胞和單克隆細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性LN215和5株單克隆細(xì)胞經(jīng)不同濃度TRAIL作用后，細(xì)胞凋亡率在 -10.2% ～55.7%之間波動(dòng)，LN215、1、6、17、13 和 32 細(xì)胞的最大凋亡率分別為12.1%、3.48%、17.4%、4.85%、55.7%和28.1%，其中6、13和32經(jīng)TRAIL作用后發(fā)生凋亡較LN215更明顯，而1和7則相反，以13對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡最為敏感。見(jiàn)圖1。

2.3 LN215細(xì)胞和單克隆細(xì)胞TRAIL相關(guān)蛋白的表達(dá)TRAIL相關(guān)蛋白均有表達(dá)。LN215細(xì)胞和單克隆細(xì)胞表達(dá)DR4與細(xì)胞凋亡百分率不相關(guān);BID、SMAC表達(dá)與細(xì)胞凋亡百分率明顯相關(guān)，6、13、32較1和17表達(dá)量明顯增加，尤其是13最為明顯。見(jiàn)圖2。

圖1 TRAIL誘導(dǎo)LN215及單克隆細(xì)胞發(fā)生凋亡情況

圖2 惡性膠質(zhì)瘤LN214細(xì)胞及單克隆細(xì)胞TRAIL相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

膠質(zhì)瘤是起源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的最常見(jiàn)腫瘤，由于其發(fā)病隱匿，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)病理診斷就是Ⅲ～Ⅳ期膠質(zhì)瘤，給臨床治療帶來(lái)了很大困難。并且由于腦膠質(zhì)瘤在腦內(nèi)呈彌散分布〔4〕，手術(shù)難以清除。這可能是由于激活細(xì)胞生長(zhǎng)途徑和/或抑制細(xì)胞凋亡途徑而對(duì)治療產(chǎn)生抵抗〔5〕。TRAIL可以誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡〔6，7〕，TRAIL誘導(dǎo)凋亡的非線粒體途徑需要線粒體途徑的補(bǔ)充，由線粒體途徑通過(guò)(caspase 8)間接激活BID，再依次與Bax和Bak作用，改變了線粒體膜的生物學(xué)特性，促使細(xì)胞色素C和SMAC等線粒體蛋白釋放。在胞質(zhì)內(nèi)，SMAC與相關(guān)蛋白作用解除抑制因子的抑制作用，使TRAIL誘導(dǎo)的非線粒體途徑得以進(jìn)行〔8，9〕，細(xì)胞發(fā)生凋亡。

根據(jù)腫瘤發(fā)生可能來(lái)源于多個(gè)細(xì)胞的突變，本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞梯度稀釋方法由LN215分離出5株單克隆細(xì)胞。LN215細(xì)胞和單克隆細(xì)胞BID、SMAC表達(dá)與細(xì)胞凋亡百分率明顯相關(guān)。因此，筆者認(rèn)為L(zhǎng)N215和單克隆細(xì)胞經(jīng)TRAIL誘導(dǎo)凋亡百分率與BID和SMAC表達(dá)量密切相關(guān)，說(shuō)明TRAIL誘導(dǎo)LN215和單克隆細(xì)胞可能是通過(guò)BID和SMAC引起，表達(dá)量的減少可能會(huì)引起TRAIL誘導(dǎo)凋亡抵抗，但更進(jìn)一步的機(jī)制仍待研究。

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