小活絡(luò)丸中非法添加松香酸的檢查方法研究

張亞雙， 閔春艷

（蘇州市藥品檢驗所，江蘇蘇州 215104）

小活絡(luò)丸中非法添加松香酸的檢查方法研究

張亞雙， 閔春艷*

（蘇州市藥品檢驗所，江蘇蘇州 215104）

目的 建立小活絡(luò)丸中非法添加松香酸的HPLC檢查法，并以HPLC/MS法加以驗證。方法 選用Waters Symmetry C18（5 μm，4.6 mm ×250 mm）；Inertsil ODS-3（5 μm，4.6 mm ×250 mm）；TURNER C18（100A，5 μm，4.6 mm×250 mm）3三種色譜柱，二極管陣列檢測器 （PDA），乙腈－0.1%甲酸溶液 （75∶25）為流動相等度洗脫，柱溫20℃，體積流量1 mL/min，檢測波長241 nm（190～300 nm）。通過比對供試品與對照品HPLC色譜及光譜，對小活絡(luò)丸中是否非法添加松香酸作定性分析。結(jié)果 小活絡(luò)丸供試品中均檢出松香酸。結(jié)論 本方法靈敏度高、準確性好，操作簡單，可用于小活絡(luò)丸中非法添加松香酸的定性檢查。

小活絡(luò)丸；松香酸；高效液相色譜；二極管陣列檢測器

小活絡(luò)丸方劑中有制川烏、制草烏、膽南星、乳香（制）、沒藥、地龍，載于宋代《太平惠民和劑局方》，有祛風(fēng)散寒除濕、化痰、活血功效，用于治療風(fēng)寒濕痹所引起的經(jīng)絡(luò)不通，肢體關(guān)節(jié)疼痛，關(guān)節(jié)屈伸不利、麻木拘攣，及中風(fēng)手足不仁等癥［1］，此外有研究表明小活絡(luò)丸還具有較強的抗炎、鎮(zhèn)痛作用［2］。

方中乳香、沒藥富含揮發(fā)油［3］，二藥并用為宣通臟腑，流通經(jīng)絡(luò)之要藥，主產(chǎn)于索馬里、埃塞俄比亞、利比亞、蘇丹、土耳其等國家［4］，國內(nèi)對其療效及活性成分進行了大量研究。近年來隨著藥材價格上漲，市場上出現(xiàn)了乳香、沒藥的偽藥及劣藥，如摻石膏粉等，楊秀澤等研究了其相應(yīng)的鑒別方法［5-6］，其中摻入松香的乳香沒藥偽品引起了我們的注意，松香的主要成分為松香酸酐和游離松香酸，有小毒［7］。有報道稱，銀屑敵膠囊因非法添加松香酸而導(dǎo)致服用者視力下降、死亡等嚴重后果。夏小中等研究了藥材中非法添加松香的理化及薄層色譜鑒別方法［8］，李麗在麝香接骨膠囊中檢出松香酸并建立了相應(yīng)的HPLC檢查法［9］。小活絡(luò)丸中乳香、沒藥經(jīng)過炮制和粉碎，理化鑒別效果不佳，薄層色譜鑒別中檢出可疑斑點，疑為松香酸，因此建立了HPLC法檢測小活絡(luò)丸中非法添加的松香酸，采用二極管陣列檢測器 （PDA）確定結(jié)果，采用UPLC-MS加以驗證［10］。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 SHIMADZU LC-20AD SlutionHPLC，二極管陣列檢測器，METTLER TOLEDO電子天平。

1.2 試藥 松香酸由A Johnson Matthey公司提供，批號為42582，小活絡(luò)丸供試品為 A公司 （大蜜丸）批號101002、B公司 （濃縮丸）批號62101204及C公司 （濃縮丸）批號10C10。乙腈 （色譜純，TEDIA公司），甲酸（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），水為超純水。

2 實驗條件與方法學(xué)考察

2.1 色譜條件［11］Waters Symmetry C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；Inertsil ODS-3（5 μm，4.6 mm × 250 mm）；TURNER C18100A（5 μm，4.6 mm×250 mm）3種色譜柱，二極管陣列檢測器，乙腈－0.1%甲酸溶液 （75∶25）為流動相等度洗脫，柱溫20℃，體積流量1 mL/min，檢測波段為190～300 nm（色譜提取波長為241 nm），進樣量為10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取松香酸對照品10 mg置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取小活絡(luò)丸供試品大蜜丸3丸，加硅藻土適量，碾勻研細或取濃縮丸10丸研細，置錐形瓶中，加甲醇35 mL，超聲處理30 min（250 W，33 kHz），離心，取上清液，0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.4 陰性干擾考察 取不含松香酸的的陰性樣品 （按供試品制備方法制備），采用 TURNER C18100A（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱依法測定，結(jié)果陰性樣品在松香酸峰相應(yīng)位置上無吸收峰，表明小活絡(luò)丸的方劑中的藥物組分對松香酸的測定無干擾，見圖1。

圖1 松香酸對照品 （A）、檢出松香酸小活絡(luò)丸樣品 （B）及不含松香酸樣品 （C）HPLC色譜圖

2.5 方法耐用性考察 選取不同型號的色譜柱：（031號柱）Waters Symmetry C18（5 μm，4.6 mm × 250 mm）；（032 號柱）Inertsil ODS-3（5 μm，4.6 mm × 250 mm）；（075 號柱）TURNER HPLC Columns C18（5 μm，4.6 mm ×200 mm），按上述測定法測定A公司生產(chǎn)小活絡(luò)丸 （大蜜丸，批號：101201）供試品溶液。松香酸特征峰分離度良好，能滿足實驗要求，方法耐用性好，見圖2。

圖2 小活絡(luò)丸中松香酸系統(tǒng)適用性試驗

2.6 線性關(guān)系考察 取松香酸對照品6.41 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別取1、3、7、10、15、20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以各自的峰面積對其注入質(zhì)量數(shù) （mg）進行線性回歸，回歸方程為Y=155 073.0 X －90 461.99，R2=0.999 9，結(jié)果表明在1.153 8～23.076 μg范圍內(nèi)，松香酸峰面積與其質(zhì)量呈良好線性關(guān)系。

2.7 定量限 將1.153 8 mg/mL的對照品溶液分別以1、3、5、7、10、15、20 μL進樣，根據(jù)峰高以信噪比 S/N=10確定松香酸的定量限為26.809 μg。

2.8 檢測限 同定量限測定方法，根據(jù)峰高以信噪比S/N=3確定松香酸的檢測限為8.847 μg。

3 實驗結(jié)果

取3個不同廠家生產(chǎn)的小活絡(luò)丸供試品，按2.3項供試品溶液制備方法制備，精密吸取供試品溶液及對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，采用TURNER C18100A（5 μm 4.6 mm×250 mm）色譜柱按2.1項色譜條件進行測定，測定結(jié)果見表1，松香酸對照品與3批供試品的HPLC圖譜及相應(yīng)光譜圖見圖3。

表1 小活絡(luò)丸中非法添加松香酸測定結(jié)果

圖3 小活絡(luò)丸中非法添加松香酸HPLC圖譜及相應(yīng)光譜圖

4 小活絡(luò)丸中非法添加松香酸的質(zhì)譜驗證

4.1 試驗儀器 Waters ACQUITY UPLC Xevo TQ液質(zhì)聯(lián)用色譜儀

4.2 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸溶液（A）；0.1%甲酸乙腈 （B）溶液按表2梯度洗脫。

表2 小活絡(luò)丸中松香酸液質(zhì)聯(lián)用分析流動相梯度洗脫

質(zhì)譜條件：離子化模式ESI+；毛細管電壓3.0 KV；源溫度150℃；脫溶劑氣溫度500℃；霧化氣體積流量900 L/h；采集參數(shù)如表3所示。

表3 小活絡(luò)丸中松香酸質(zhì)譜分析采集參數(shù)表

4.3 質(zhì)譜驗證結(jié)果 本實驗采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 （UPLC-MS）技術(shù)對上述松香酸檢驗結(jié)果進行驗證，利用液相保留時間 （RT=1.79min）和松香酸正離子（［M+1］+=303.17）模式下不同碰撞能量產(chǎn)生的3個特征子離子 （257.21，123.12和105.04）來判斷是否含有松香酸，UPLC-MS具有高效、精確、分離效果好等優(yōu)點［12］，結(jié)果顯示能夠?qū)λ上闼徇M行定性定量驗證。結(jié)果如表4及圖4～圖7所示，供試品中均檢出與松香酸對照品相同的3個特征子離子，即檢出松香酸。

表4 小活絡(luò)丸中非法添加松香酸的質(zhì)譜檢測結(jié)果

圖4 松香酸對照品質(zhì)譜圖

圖5 小活絡(luò)丸 （A公司生產(chǎn)）質(zhì)譜圖

5 討論

通過實驗得知當前原料藥材的控制存在一定問題，添加有松香酸的乳香沒藥等藥材已經(jīng)流入中成藥生產(chǎn)領(lǐng)域，從而導(dǎo)致中成藥中含有松香酸，除了在原料藥材上加強把關(guān)力度外，在含有乳香沒藥等藥材的中成藥標準中增加松香酸非法添加的檢查法也已經(jīng)迫在眉睫。

質(zhì)譜驗證結(jié)果表明目前所建立的小活絡(luò)丸中非法添加松香酸HPLC檢查法結(jié)果準確、方法可行，可以作為小活絡(luò)丸標準中松香酸的檢查法對其進行有效控制，具有較強的現(xiàn)實意義。

圖6 小活絡(luò)丸 （B公司生產(chǎn)）質(zhì)譜圖

圖7 小活絡(luò)丸 （C公司生產(chǎn)）質(zhì)譜圖

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R927.1

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1001-1528（2013）04-0867-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.04.059

2012-05-07

張亞雙 （1981—），女，主管中藥師，研究方向：中藥飲片真?zhèn)舞b定、中成藥質(zhì)量標準提升。Tel：（0512）68223525，E-mail：ysz3366@126.com

*通信作者：閔春艷 （1979—），女，主管中藥師，研究方向：中藥質(zhì)量控制。Tel：（0512）68223525，E-mail：minchunyan0609@hotmail.com