復(fù)方萸葛降糖顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

顧娟娟，陸兔林，毛春芹，王 菊，胡穎菲，張 星

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210046）

復(fù)方萸葛降糖顆粒由山茱萸、葛根、姜黃等多味中藥經(jīng)提取、加工、精制而成，具有清利活血，滋腎養(yǎng)陰的功效，臨床上用于治療Ⅱ型糖尿病心腦血管并發(fā)癥。方中山茱萸滋腎養(yǎng)陰，葛根清熱生津，兩藥合用，共為君藥。山茱萸中主要成分為:環(huán)烯醚萜苷類和有機(jī)酸類等，其中以馬錢苷為代表的環(huán)烯醚萜總苷能保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，對糖尿病血管并發(fā)癥具有明顯的改善作用［1］；葛根中主要成分為異黃酮類，異黃酮類成分中葛根素具有抑制蛋白質(zhì)非酶糖基化，改善胰島素抵抗的作用［2］；姜黃中主要成分為:揮發(fā)油類和姜黃素類［3］。為了有效控制復(fù)方萸葛降糖顆粒質(zhì)量，本實驗研究采用薄層色譜法對方中山茱萸、葛根和姜黃進(jìn)行了定性鑒別，并采用高效液相色譜法測定本制劑中馬錢苷和葛根素的量，綜合評價制劑的內(nèi)在質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀 (美國Agilent公司)，包括:四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、VWD紫外檢測器；WD-9403C型紫外分析儀(上海精勝科學(xué)儀器有限公司)；KQ-500E型醫(yī)用超聲清洗器 (昆山超聲儀器有限公司)；AG285型電子分析天平 (梅特勒-托利多公司)。

馬錢苷對照品 (批號:111640-201005)、葛根素對照品 (批號:110752-200912)、山茱萸對照藥材 (批號:121495-200702)、葛根對照藥材 (批號:121551-200902)、姜黃對照藥材 (批號:121188-200502)均購自中國藥品生物制品檢定所；薄層色譜用硅膠G(青島海洋化工有限公司)；復(fù)方萸葛降糖顆粒 (實驗室自制，批號為:120213、120215、120217)；乙腈、甲醇為色譜純；其他所用試劑為分析純；水為石英雙重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 山茱萸的薄層色譜鑒別［4-6］取本品顆粒2 g，研細(xì)，加20 mL乙酸乙酯，超聲處理15 min，濾過，濾液揮干，加2 mL無水乙醇溶解殘渣，即得供試品溶液。取山茱萸對照藥材0.5 g，同法制備得對照藥材溶液。另取熊果酸對照品，加無水乙醇制備成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取不含山茱萸的其他處方量飲片，按制備工藝制成缺山茱萸的陰性制劑樣品，按供試品溶液制備方法制備，作為缺山茱萸的陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述溶液各5 μL，點于同一塊硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸 (20∶4∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃下加熱至斑點顯色清晰，置于紫外光燈365 nm下檢視。供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應(yīng)位置，顯相同顏色熒光斑點，而陰性對照無此斑點，結(jié)果見圖1。

圖1 山茱萸的薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of Corni Fructus

取本品顆粒2 g，研細(xì)，加30 mL乙醇，加熱回流1 h，濾過，濾液揮至無醇味，加水溶解，過D101型大孔樹脂 (內(nèi)徑1.5 cm，長10 cm)，水洗至無色，依次用30%乙醇，50%乙醇各50 mL洗脫，合并洗脫液，揮干，殘渣加2 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取山茱萸對照藥材0.5 g，同法制備成對照藥材溶液。另取馬錢苷對照品，加甲醇制備成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取除山茱萸外的其他處方量飲片，按制備工藝制成缺山茱萸的陰性樣品，照供試品溶液的制備方法制備，作為缺山茱萸的陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述溶液各5 μL，點于同一塊硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-乙醇-冰醋酸 (50∶10∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，105℃下加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應(yīng)位置，顯相同的紫紅色斑點，而陰性對照無此斑點，結(jié)果見圖2。

圖2 山茱萸的薄層色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of Corni Fructus

2.1.2 葛根的薄層色譜鑒別［4，7］取本品顆粒2 g，研細(xì)，加20 mL甲醇，超聲處理30 min，濾過，濾液揮干，加1 mL甲醇溶解殘渣，即得供試品溶液。取葛根對照藥材0.8 g，同法制備成對照藥材溶液。另取葛根素對照品適量，加甲醇制備成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取不含葛根的其他處方量飲片，按制備工藝制成缺葛根的陰性樣品，照供試品溶液的制備方法制備，作為缺葛根的陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述溶液各10 μL，點于同一塊硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-水-甲苯 (13∶11∶2.4∶1.4)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光燈365 nm下檢視。供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應(yīng)位置，顯相同顏色熒光斑點，而陰性對照無干擾，結(jié)果見圖3。

圖3 葛根的薄層色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of Puerariae lobatae Radix

2.1.3 姜黃的薄層色譜鑒別［8］取本品顆粒5 g，研細(xì)，加水100 mL，水蒸氣蒸餾提取3 h，收集所得揮發(fā)油，用少許乙醚沖洗揮發(fā)油提取器管壁，乙醚液合并至所得揮發(fā)油中，所提的揮發(fā)油用乙醚振搖提取兩次，每次10 mL，合并乙醚振搖提取液，低溫?fù)]干乙醚，殘渣加甲醇1 mL使之溶解，作為供試品溶液。另取姜黃對照藥材1 g，同法制備成對照藥材溶液。再取除姜黃外的其他處方量飲片，按制備工藝制成缺姜黃的陰性樣品，同法操作制備成缺姜黃的陰性對照溶液。照《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B薄層色譜法試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，點于同一塊硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯 (9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置，顯相同顏色斑點，而陰性對照無干擾，結(jié)果見圖4。

圖4 姜黃的薄層色譜圖Fig.4 TLC chromatogram of Curcumae longae Rhizoma

2.2 定量測定

2.2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水 (10∶90)；檢測波長240 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃。理論板數(shù)按馬錢苷峰計算應(yīng)不低于3000，按葛根素峰計算應(yīng)不低于4000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取馬錢苷對照品和葛根素對照品適量，加80%甲醇制成馬錢苷和葛根素質(zhì)量濃度分別為0.0618 mg/mL和0.4100 mg/mL的混合溶液，作為混合對照品貯備溶液。精密吸取上述混合對照品貯備溶液2 mL，置于10 mL量瓶中，加80%甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品顆粒，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按本品處方及制備工藝分別制備缺山茱萸及缺葛根的陰性樣品，照2.2.3項供試品溶液的制備方法處理，即得缺山茱萸及缺葛根的陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按2.2.1項色譜條件進(jìn)行色譜分離，記錄色譜圖，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，本色譜條件下，供試品溶液中其他成分與馬錢苷和葛根素分離良好，陰性對照色譜圖中馬錢苷峰和葛根素峰處不出峰，對測定結(jié)果無干擾。

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述混合對照品貯備溶液1、2、4、6、8、10 mL，置10 mL量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對照品溶液。分別精密吸取上述6個質(zhì)量濃度的混合對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，重復(fù)兩次，按2.2.1項色譜條件測定馬錢苷和葛根素的峰面積值。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，測得的峰面積平均值作為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，分別得馬錢苷線性方程:Y=17736X－3.3468，r=0.9993，葛根素線性方程:Y=33790X－62.094，r=0.9994，結(jié)果表明馬錢苷、葛根素分別在0.0618 ～0.6180 μg、0.4100 ～4.1000 μg的質(zhì)量范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖5 混合對照品(A)、供試品(B)、缺葛根陰性對照(C)和缺山茱萸陰性對照(D)的HPLC圖譜Fig.5 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)，sample(B)，negative sample without Puerariae lobatae Radix(C)，and negative sample without Corni Fructus(D)

2.2.7 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液(馬錢苷和葛根素質(zhì)量濃度分別為0.0618 mg/mL、0.4100 mg/mL)10 μL，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測定馬錢苷、葛根素的峰面積值，結(jié)果馬錢苷和葛根素峰面積值的RSD分別為0.33%、0.35%。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取批號為120215的顆粒樣品，按2.2.3項供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，取上述溶液分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣10 μL，測定馬錢苷、葛根素的峰面積值，計算其RSD分別為2.13%、1.35%，結(jié)果表明:本供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗 取批號為120215的顆粒樣品，按2.2.3項供試品溶液的制備方法平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣10 μL，測定馬錢苷、葛根素的峰面積值，計算得馬錢苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.41 mg/g，RSD為0.84%；葛根素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.89 mg/g，RSD為0.70%。

2.2.10 準(zhǔn)確度試驗 精密稱取批號為120215的顆粒樣品0.25 g，共9份，分別置具塞錐形瓶中，再精密加入質(zhì)量濃度為0.3450 mg/mL馬錢苷、3.4000 mg/mL葛根素混合對照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，各平行3份，照2.2.3項供試品溶液的制備方法制備樣品，取10 μL樣品溶液，注入液相色譜儀，色譜條件同前，記錄色譜圖中馬錢苷和葛根素的峰面積，計算加樣回收率。結(jié)果見表1與表2。

表1 馬錢苷準(zhǔn)確度試驗結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests of loganin

2.2.11 樣品測定 取3個批次的樣品，按2.2.3項供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，每批樣品平行3份，進(jìn)樣測定，計算樣品中馬錢苷及葛根素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表3。

表2 葛根素準(zhǔn)確度試驗結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests of puerarin

表3 樣品馬錢苷和葛根素測定結(jié)果(n=3)Tab.3 Determination of loganin and puerarin in Compound Yuge Jiangtang Granules(n=3)

3 討論

3.1 在鑒別山茱萸中馬錢苷時，首先參照《中國藥典》方法直接用無水乙醇超聲處理樣品，結(jié)果供試品色譜中背景干擾強(qiáng)。針對山茱萸含有可溶于水的環(huán)烯醚萜苷類化合物，用大孔樹脂對總苷進(jìn)行分離、純化。本實驗研究比較了3種不同展開系統(tǒng)在山茱萸薄層色譜鑒別中的展開效果，展開系統(tǒng)Ⅰ為乙酸乙酯-乙醇-冰醋酸 (50∶10∶1)；展開系統(tǒng)Ⅱ為二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸 (40∶5∶10∶0.2)；展開系統(tǒng)Ⅲ為二氯甲烷-甲醇 (4∶1)，結(jié)果在供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應(yīng)位置，均顯相同顏色斑點，陰性對照均無干擾，其中以展開系統(tǒng)Ⅰ分離效果最好。

3.2 通過紫外全波長掃描的光譜圖可知，馬錢苷在240 nm處有最大吸收，葛根素在250 nm處有最大吸收?？紤]葛根素在240 nm處吸收也較強(qiáng)，故選擇240 nm作為檢測波長。

3.3 本實驗考察了不同溶劑系統(tǒng)，如甲醇-水、乙腈-水對色譜峰分離效果的影響。結(jié)果表明以不同比例的甲醇-水為流動相的分離效果均不理想，以乙腈-水 (10∶90)為流動相分離效果好。本實驗也曾嘗試用乙腈-水進(jìn)行梯度洗脫，雖然可將待測組分完全分離，但并未縮短分析時間，且成本增加，故最終選擇乙腈-水 (10∶90)作為流動相。

3.4 為了充分提取復(fù)方萸葛降糖顆粒中的有效成分，本實驗研究考察了超聲提取和回流提取兩種不同的提取方法。結(jié)果表明:兩種提取方法的提取效率均可，但超聲提取相對操作簡便、快捷，故本實驗研究確定以超聲處理作為提取方法。參照《中國藥典》(2010年版一部)及相關(guān)文獻(xiàn)［4，9-15］中山茱萸及葛根的提取方法，考察不同提取溶劑(30%、50%、80%、100%甲醇及 30%、50%、70%乙醇)對馬錢苷及葛根素量的影響，結(jié)果表明兩者以80%甲醇作為提取溶劑時的提取效率最高，所以采用80%甲醇作為提取溶劑。同時本實驗研究還考察了不同超聲時間 (15、30、45 min)對兩者的影響，結(jié)果表明超聲30 min和45 min二者的量差別不大，故確定供試品溶液制備方法采用超聲提取30 min。

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