HPLC 法測定不同廠家三七傷藥片中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿

汪劍飛

（蕪湖市食品藥品檢驗所，安徽蕪湖 241001）

HPLC 法測定不同廠家三七傷藥片中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿

汪劍飛

（蕪湖市食品藥品檢驗所，安徽蕪湖 241001）

目的 建立HPLC法測定不同廠家三七傷藥片 （三七、草烏、雪上一枝蒿、紅花等）中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿。方法 采用Intersil C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-0.1%三乙胺為流動相進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長235 nm；柱溫為35℃；體積流量1.0 mL/min。結(jié)果 不同廠家三七傷藥片中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的含有量差異懸殊。結(jié)論 該法靈敏度高，重復(fù)性好，能準(zhǔn)確測定三七傷藥片中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿，為烏頭堿限量檢查提供參考依據(jù)。

HPLC；三七傷藥片；烏頭堿；新烏頭堿；次烏頭堿

三七傷藥片收載于《中國藥典》2010年版一部，由三七、草烏 （蒸）、雪上一枝蒿、紅花等八味中藥組成，具有舒筋活血、散瘀止痛的功能，用于治療跌打損傷、風(fēng)濕瘀阻、關(guān)節(jié)痹痛、扭挫傷、神經(jīng)痛［1］451。其中草烏及雪上一枝蒿中的雙酯型二萜類生物堿烏頭堿、次烏頭堿即是鎮(zhèn)痛、抗炎的有效成分，又是毒性成分［2］?！吨袊幍洹穼躅^堿做了限量檢查，采用薄層色譜法［1］451，該方法既不能有效控制烏頭堿的限量，又不能保證藥品的內(nèi)在質(zhì)量及有效性。為此筆者收集市場上在售的同一廠家不同批號及不同廠家的三七傷藥片，同時測定其中的烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜儀，2489紫外檢測器 （沃特世公司）；AB304-S電子天平和XP-205電子天平［梅特勒-托利多儀器 （上海）有限公司］；超聲波清洗儀 （上海杰理科技有限公司）。

1.2 試藥 烏頭堿 （110789-200404），新烏頭堿（110799-200404）、次烏頭堿 （110720-200410），均為定量測定用，均購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇 （色譜純），水為雙蒸水，其余試劑均為分析純；三七傷藥片 （市售品），陰性三七傷藥片按處方缺草烏 （蒸）、雪上一枝蒿配制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Intersil C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長235 nm；柱溫35℃；體積流量為1.0 mL/min；流動相為甲醇-0.1%三乙胺，按表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Procedure of gradient elution

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的配制 精密稱取烏頭堿對照品9.66 mg，新烏頭堿對照品10.38 mg，次烏頭堿對照品9.64 mg，分別置入同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液的配制 取三七傷藥片40片，除去糖衣，精密稱定，研細(xì)，精密稱取7.5 g（相當(dāng)于30片），加入濃氨試液4 mL，浸潤10 min，加入乙醚150 mL，振搖10 min后超聲提取10 min，過濾，再以50 mL乙醚分次洗滌濾渣及濾紙，合并濾液及洗液，40℃以下回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取陰性樣品7.5 g，按2.2.2項供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 按照2.1項色譜條件，吸取對照品溶液10 μL，供試品溶液、陰性對照溶液各20 μL，分別注入高效液相色譜儀，結(jié)果見圖1。表明其他藥味不干擾供試品溶液中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的測定。

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取對照品貯備液 62.5、125、250、500、1 000 μL，分別置 10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，分別精密吸取上述溶液10 μL進(jìn)樣，按照2.1項下條件測定峰面積，以對照品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積 （Y）為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的回歸方程分別為：Y=2 251 717.52X－52 666.44（r=0.999 5，n=5），Y=2 371 218.18X+22 261.58（r=0.999 0，n=5），Y=2 408 303.27X－42 079.31（r=0.999 8，n=5），結(jié)果表明三者進(jìn)樣量分別在0.060 4～0.966 μg，0.064 9 ～ 1.038 μg，0.060 2 ～ 0.964 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 三七傷藥片中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mesaconitine aconitine and hypaconitine in Sanqi Shangyao Tablets

2.3.3 精密度試驗 精密量取同一對照品溶液10 μL，按2.1項色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿峰面積的RSD分別為1.88%、0.84%、1.04%，表明精密度良好，滿足定量測定要求。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，按2.1項色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿峰面積的RSD分別為1.81%，1.96%，2.26%。表明3種生物堿在甲醇溶液中24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗 取同一批樣品，共5份，按2.2.2項下的方法制成供試品溶液，各進(jìn)樣20 μL，按2.1項色譜條件測定，烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的含量分別為 0.92 μg/片、4.23 μg/片和2.01 μg/片，RSD 分 別 為 1.97%、2.74% 和1.64%。結(jié)果表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.3.6 檢測限 取混合對照品貯備液，進(jìn)行定量倍比稀釋，進(jìn)樣并記錄色譜圖，直到信噪比為3∶1，計算烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的檢測限分別為1.9 ng、2.1 ng、1.9 ng。

2.3.7 回收率試驗 精密稱取已知烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿量的樣品9份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對照品貯備液0.25、0.5、1.0 mL各3份，按2.2.2項供試品溶液制備方法處理，定容至10 mL量瓶中，制成供試品溶液，按2.1項色譜條件測定并計算回收率，結(jié)果烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的平均回收率分別為97.6%、98.8%、95.5%，RSD分別為 2.07%、2.33%、1.26%，表明該方法的回收率良好。見表2。

2.4 樣品測定 精密稱取不同批號的樣品細(xì)粉各7.5 g（每批平行取3份），分別按2.2.2項下方法處理制成供試品溶液。按2.1項色譜條件測定并計算烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿及三者的總量，結(jié)果見表3。

表2 回收率試驗結(jié)果 （n=9）Tab.2 Results of recovery tests（n=9）

3 討論

3.1 檢測波長及色譜條件的選擇 參考《中國藥典》2010年版一部草烏與制草烏的【含量測定】項［1］220-221及參考文獻(xiàn)［3-4］，檢測波長考察了 230 nm、235 nm及240 nm 3個檢測波長，3個組分在此波長下都有良好的吸收，最終選擇檢測波長為235 nm；流動相考察了甲醇-0.1%三乙胺、乙腈-乙酸銨緩沖液 （pH=10.5）、乙腈-四氫呋喃-乙酸銨等，進(jìn)行不同比例的等度洗脫及梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗的色譜條件分離效果最好。

表3 樣品測定結(jié)果 （n=3）Tab.3 Determination results of samples（n=3）

3.2 樣品處理方法的考察 烏頭堿類為脂溶性生物堿，在提取溶媒上主要考察了乙醚、三氯甲烷以及異丙醇-乙酸乙酯 （1∶1），在加同樣濃氨試液的條件下，三者提取效率無明顯差別，考慮到三氯甲烷的毒性遠(yuǎn)大于乙醚，所以選擇乙醚為提取溶媒；還考察了濃氨試液用量 （2、4、6 mL）和提取時間 （5 min、10 min、15 min），加濃氨試液4 mL超聲提取10 min的效果最優(yōu)；烏頭堿受熱易水解為烏頭原堿，乙醚液蒸干的溫度以不超過40℃為宜［3］。

3.3 8批樣品中烏頭堿限量按照國家標(biāo)準(zhǔn)［1］檢測均符合規(guī)定，而使用本法測定的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的量及三者總量相差懸殊，因此筆者認(rèn)為，在制定烏頭堿限量的標(biāo)準(zhǔn)時，既要控制上限保證安全性，也要制定下限保證有效性。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［2］龔千峰，丁安偉，孫秀梅，等.中藥炮制學(xué)［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：310-314.

［3］張興德，郁紅禮，崔小兵.HPLC測定癌痛寧凝膠劑中烏頭堿含量［J］.中成藥，2007，29（12）：1862-1863.

［4］丘振文，羅丹冬，王佩堅.HPLC法測定舒痹寧顆粒中次烏頭堿、新烏頭堿的含量［J］.中國新藥與臨床藥理，2008，19（4）：304-306.

［5］張啟云，朱戰(zhàn)杰，余日躍，等.RP-HPLC法測定白附片中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿［J］.中國試驗方劑學(xué)雜志，2007，13（12）：1-3.

［6］王 瑞，劉 芳，孫毅坤，等.不同附子炮制品中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿含量的HPLC測定［J］.藥物分析雜志，2006，26（10）：1361-1363.

［7］鄧雅瓊，劉榮華，邵 峰，等.反相高效液相色譜法測定附子中烏頭堿等3種成分的含量［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20（5）：1038-1039.

［8］劉玉蘭，劉世坤，裴 奇，等.高效液相色譜法測定附子中3組分的含量［J］.中國藥房，2006，17（16）：1255-1266.

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Determination of aconitine，mesaconitine and hypaconitine in Sanqi Shangyao Tablets from different factories by HPLC

WANG Jian-fei
（Wuhu Municipal Institute for Food＆Drug Control，Wuhu 241001，China）

HPLC；Sanqi Shangyao Tablets；aconitine；mesaconitine；hypaconitine

R927.2

A

1001-1528（2013）04-0717-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.04.018

2012-04-27

汪劍飛 （1982—），男，主管中藥師，研究方向：藥品檢驗。Tel：18019533956