結腸康對惡唑酮誘導小鼠潰瘍性結腸炎MPO、NO、iNOS的影響

關麗華， 龔玉芳， 張 弘， 商亞珍*

（1.河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室/承德醫(yī)學院中藥研究所，河北承德067000；2.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北承德 067000）

結腸康對惡唑酮誘導小鼠潰瘍性結腸炎MPO、NO、iNOS的影響

關麗華1， 龔玉芳1， 張 弘2， 商亞珍1*

（1.河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室/承德醫(yī)學院中藥研究所，河北承德067000；2.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北承德 067000）

目的 觀察中藥復方結腸康 （黃芪、白術、茯苓、延胡索、黃連、三七等）對惡唑酮誘導小鼠潰瘍性結腸炎中髓過氧化物酶 （MPO）活性、一氧化氮 （NO）水平、誘導型一氧化氮合酶 （iNOS）蛋白表達的影響，并探討其治療潰瘍性結腸炎的作用機制。方法 小鼠頸背部3%惡唑酮致敏2 d，第6天用1.5%惡唑酮灌腸，灌腸當日開始灌胃不同劑量結腸康。灌胃3 d后，處死小鼠，測定結腸組織MPO活性和NO水平，免疫組織化學檢測iNOS蛋白表達。柳氮磺胺吡啶作為陽性對照藥。結果 與空白對照組相比，模型組MPO活性顯著增加 （P＜0.01），NO水平、iNOS表達顯著增加 （P＜0.01）；結腸康 （6.4、12.8、25.6 g/kg）組和柳氮磺胺吡啶 （0.2 g/kg）組均能顯著降低MPO活性、NO水平和iNOS蛋白表達 （P＜0.01）；陽性對照藥柳氮磺胺吡啶也有相似作用。結論 中藥復方結腸康對惡唑酮誘導小鼠潰瘍性結腸炎MPO活性、NO水平、iNOS表達有一定的影響，對潰瘍性結腸炎具有一定的治療作用。

結腸康；潰瘍性結腸炎；髓過氧化物酶 （MPO）；一氧化氮 （NO）；一氧化氧合酶 （iNOS）

炎癥性腸病 （Inflammatory bowel disease）是一組病因和發(fā)病機制不明的慢性腸道非特異性炎性疾病，包括克羅恩病 （Crohn's disease）和潰瘍性結腸炎 （Ulcerative colitis）。其病變位于大腸，呈連續(xù)性彌漫性分布，多數(shù)累及直腸和乙狀結腸。其中潰瘍性結腸炎的典型臨床癥狀包括黏液膿血便和腹痛腹瀉。由于潰瘍性結腸炎病變范圍廣泛、病情反復發(fā)作、治療效果欠佳，病情遷延不愈，癌變可能性大，該病已被WHO確定為現(xiàn)代難治疾?。?］。

惡唑酮 （Oxazolone）是一種半抗原，可以在動物機體各個部位誘發(fā)接觸性過敏反應。Heller等［2］研究發(fā)現(xiàn)，惡唑酮誘導的潰瘍性結腸炎是一種IL-4介導的輔助型Th2型炎癥，其腸炎模型，動物表現(xiàn)為懶動、體質(zhì)量減輕、稀便或血便等，與潰瘍性結腸炎臨床過程接近［3］。國內(nèi)現(xiàn)多采用中醫(yī)或中西醫(yī)結合方法治療本病，具有臨床療效好、復發(fā)率低、不良反應少等優(yōu)點［4］。中藥復方結腸康是多年在臨床應用治療潰瘍性結腸炎的經(jīng)驗方，由藿香、炒白術、茯苓、元胡、柴胡、三七粉、甘草等十九味中藥組成，根據(jù)中醫(yī)理論，該組方具有化濕和中、益氣健脾、清熱燥濕、溫中澀腸、活血止痛之功效，本組方多成分、多靶點調(diào)節(jié)起效，臨床觀察療效好，總有效率100%，近期治愈率50%，本方在課題組前期實驗已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對葡聚糖和三硝基苯磺酸潰瘍性結腸炎模型小鼠也具有一定的治療作用［5-6］。本實驗擬建立惡唑酮結腸炎小鼠模型，觀察中藥復方結腸康對惡唑酮所致小鼠潰瘍性結腸炎的治療作用探討結腸康治療潰瘍性結腸炎的可能機理。

1 材料與方法

1.1 動物 健康KM小鼠120只，7～8周，體質(zhì)量22～24 g，河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供 （合格證編號：1006001）。

1.2 試劑 惡唑酮購自Sigma公司，結腸康由本實驗室自制，柳氮磺胺吡啶 （上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司），髓過氧化物酶 （MPO）、一氧化氮（NO）試劑盒 （南京建成生物工程研究所），誘導型一氧化氮合酶 （iNOS）抗體 （武漢博士德生物技術有限公司），免疫組化染色試劑盒 （SP-9000）（北京中杉金橋生物技術有限公司），DAB染色試劑盒 （武漢博士德生物技術有限公司）。

1.3 結腸康的配制 按結腸康中藥方，總劑量210 g（三七粉除外），置于燒杯中，加適量蒸餾水浸泡30 min，煮沸后微沸30 min，濾出頭煎，藥渣加適量水煮沸后微沸30 min，濾出二煎，合并兩次煎液靜置沉淀后加熱濃縮至160 mL，溫度降至室溫后加三七粉，研磨均勻，結腸康藥液質(zhì)量濃度為1.28 g/mL。結腸康12.8 g/mL劑量組小鼠用藥量相當于人用藥量的7.5倍，結腸康6.4 g/mL劑量組小鼠用藥量相當于人用藥量的3.75倍。

1.4 方法

1.4.1 小鼠結腸炎模型的建立 將120只KM小鼠分組，其中正常對照組10只，其余參考Heller等［3］方法建立惡唑酮誘導結腸炎模型：小鼠頸背部皮膚剃毛 （2 cm×2 cm），配制3% 惡唑酮（100% 乙醇溶液），取0.2 mL滴在小鼠皮膚上，自然風干，24 h后重復致敏一次。5 d后灌腸：配制1.5%惡唑酮乙醇溶液，小鼠麻醉，用硅膠管鈍頭插入小鼠肛門約4 cm，抽取0.15 mL 1.5%惡唑酮 （50%乙醇溶液）順硅膠管注入小鼠肛門，速度不宜過快，完成后倒提鼠尾60 s，使溶液完全吸收，對照組同樣處理，不加惡唑酮。根據(jù)小鼠毛色暗淡、體質(zhì)量減輕、少食、懶動、稀便或血便判斷小鼠造模成功。造模成功小鼠隨機分為5個組，模型組、結腸康組 （6.4、12.8和25.6 g/kg）和柳氮磺胺吡啶組 （0.2 g/kg）。藥物干預組小鼠每日灌胃給予相應藥物，空白對照組和模型組灌胃給予蒸餾水，灌胃容積為0.2 mL/10 g體質(zhì)量，正常飼養(yǎng)。

1.4.2 髓過氧化物酶 （MPO）測定 灌胃3 d后處死小鼠，取病變嚴重結腸固定，包埋，其余結腸組織稱定質(zhì)量，按1∶9生理鹽水勻漿，將其加入鄰連茴香胺-H2反應體系中，混勻，60℃水浴孵育10 min，通過供氫體鄰連茴香胺供氫后生成黃色化合物。取出后立即在460 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測定各管吸光度值，從而推算出MPO的活力。酶活力單位定義：每克組織濕片在37℃反應體系中H2O2被分解1 μmol為1個酶活力單位。計算公式為：

MPO（IU/g濕片）=（測定管OD值－對照管OD值）/［11.3×取樣量（g）］

1.4.3 一氧化氮 （NO）的測定 取0.5 mL組織勻漿上清置測定管，0.5mL硝酸鉀標準液置標準管，0.5 mL雙蒸水置空白管，試劑按說明書操作，混勻后室溫靜置10 min，于550 nm波長0.5 cm光徑比色，分別讀取各管吸光度值，計算NO水平。

計算公式：NO水平 （μmol/gprot）=（測定管吸光度 －空白管吸光度） ×標準品濃度 （20 μmol/L）/［（標準管吸光度－空白管吸光度）×樣本的蛋白水平 （gprot/L）］

1.4.4 免疫組化SP法測iNOS 結腸iNOS的表達采用SP免疫組織化學法檢測 （按試劑盒說明書操作）。封片后，每張切片隨機選取5個高倍視野，進行陽性程度的測定，用平均吸光度值表示其強弱，若平均吸光度值高則說明其表達強，反之該值低則說明其表達弱。

1.4.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包統(tǒng)計學處理，計算相關系數(shù)及假設t檢驗進行直線相關回歸分析；組間多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析 （one-way ANOVA），P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對結腸組織MPO活性的影響 模型組MPO活性較正常對照組顯著增高129.09%（P＜0.01）；結腸康 （6.4、12.8、25.6 g/kg）組和柳氮磺胺吡啶組MPO活性較模型組顯著降低為26.98%、30.16%、46.83%和42.06%（P＜0.01），且結腸康25.6 g/kg組與柳氮磺胺吡啶組比較差異無顯著性 （P＞0.05），結腸康劑量與MPO水平進行直線相關 分 析，r= －0.983 9，假 設 檢 驗t=－11.026 5，P=0.000 4＜0.05，提示結腸康的作用呈明顯劑量依賴性有效降低結腸炎所致小鼠結腸MPO活性升高 （表1）。

2.2 對結腸組織NO水平的影響 模型組NO水平較正常對照組顯著增高693.33%（P＜0.01）；結腸康 （6.4、12.8和25.6 g/kg）組和柳氮磺胺吡啶組NO水平較模型組顯著降低54.9%、64.99%、84.03%和81.79%（P＜0.01），且結腸康25.6 g/kg組與柳氮磺胺吡啶組比較差異無顯著性 （P＞0.05），提示結腸康有效降低結腸炎所致小鼠結腸NO水平升高 （表1）。

2.3 對結腸組織iNOS蛋白表達的影響 正常對照組小鼠結腸組織僅見少量iNOS蛋白表達，模型組小鼠結腸iNOS平均吸光度值與正常對照組相比顯著增高476.62% （P＜0.01）。結腸康（6.4、12.8、25.6 g/kg）組和柳氮磺胺吡啶組小鼠結腸組織iNOS的平均吸光度值較模型組顯著降 低 25.21%、31.51%、74.4%和 79.82%（P＜0.01），但仍高于正常對照組，且結腸康12.8、25.6 g/kg組結腸iNOS平均吸光度值與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05），結腸康劑量與iNOS表達進行直線相關分析，r= －0.976 9，假設檢驗t= －9.137，P=0.000 8＜0.05，提示結腸康的作用呈明顯劑量依賴性，能有效降低結腸炎所致小鼠結腸iNOS蛋白表達升高 （圖1，表1）。

表1 結腸康對惡唑酮誘導小鼠潰瘍性結腸炎MPO活性、NO水平和iNOS蛋白表達的影響（n=8，±s）Tab.1 Effects of Jiechangkang on MPO activity，NO contents and the expression of iNOS of mice with experimental colitis（n=8，±s）

表1 結腸康對惡唑酮誘導小鼠潰瘍性結腸炎MPO活性、NO水平和iNOS蛋白表達的影響（n=8，±s）Tab.1 Effects of Jiechangkang on MPO activity，NO contents and the expression of iNOS of mice with experimental colitis（n=8，±s）

注：與空白對照組相比，＊＊P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01。

分 組 MPO 活性/（IU·g－1） NO/（μmol·gprot－1） iNOS/（μmol·gprot－1）正常對照組0.55±0.16 0.45±1.05 3.55±1.06模型組 1.26±0.18＊＊ 3.57±0.94＊＊ 20.47±4.31＊＊結腸康6.4 g/kg組 0.92±0.05## 1.61±0.60## 15.31±1.75##結腸康12.8 g/kg組 0.88±0.04## 1.25±0.36## 14.02±1.04##結腸康25.6 g/kg組 0.67±0.12## 0.57±0.13## 5.24±1.91##柳氮磺胺吡啶組 0.73±0.10## 0.65±0.16## 4.13±0.95##

結果顯示，正常對照組黃染顏色很淡，小鼠結腸組織僅見少量iNOS蛋白表達。模型組深色黃染，iNOS表達比正常對照組顯著增高。結腸康25.6 g/kg、12.8 g/kg、6.4 g/kg組，黃染顏色逐漸變淡，iNOS蛋白表達不同程度減少。柳氮磺胺吡啶組陽性對照藥物組，黃染顏色較淡，與空白對照組接近。

2.4 MPO與NO，NO與iNOS表達相關性分析MPO其水平增高可以反映中性粒細胞在某一組織中的增高，間接反映炎癥在組織中的存在，MPO活性越高，說明組織炎癥程度越重。本實驗結果中NO與MPO活性呈正相關 （t=7.989 3，r=0.97，P=0.001 4，P＜0.05），說明NO過量生成在潰瘍性結腸炎發(fā)生、發(fā)展過程中起一定作用，炎癥越重，NO水平越高。iNOS與 NO水平呈正相關（t=4.332 6，r=0.908，P=0.012 3，P＜0.05），iNOS受到一定刺激后持續(xù)釋放大量NO對腸黏膜有毒性損傷及促炎作用炎癥程度越重，iNOS蛋白表達越多。

圖1 結腸康對惡唑酮誘導小鼠潰瘍性結腸炎iNOS表達的影響（×100）Fig.1 Effects of Jiechangkang on the expression of iNOS in colonic mucosa of mice with experimental colitis（×100）

3 討論

潰瘍性結腸炎的病理機制至今尚不清楚，大多研究認為眾多生化介質(zhì)，包括細胞因子、生長因子、NO、黏附分子等在介導這一異常的免疫反應中起著重要作用。目前認為遺傳易感人群的腸黏膜免疫調(diào)節(jié)異常，持續(xù)腸道感染，腸黏膜屏障缺損和環(huán)境等因素共同參與了潰瘍性結腸炎發(fā)生過程［7-8］。潰瘍性結腸炎屬于中醫(yī)學的痢疾、泄瀉、腸癖、滯下、腸風、臟毒等范疇，以腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重等為主要癥狀，伴乏力、發(fā)熱、進行性消瘦等全身癥狀。中醫(yī)學認為其多由外感六淫之邪，內(nèi)傷七情、勞倦過度及飲食不節(jié)所引起，其病因病機多由素體脾胃損傷、傳導失司、郁久化熱、水濕內(nèi)停、濕熱蘊腸、腸絡受損、血腐肉敗化為膿血，從而形成本虛標實、寒熱錯雜之證［9］。

對于炎癥性腸病的常規(guī)治療仍首先選擇氨基水楊酸 （含柳氮磺胺吡啶和5-氨基水楊酸）、皮質(zhì)激素、免疫抑制藥物，藥物的選擇取決于臨床治療的目標、病變的范圍、對藥物的依從性和出現(xiàn)并發(fā)癥與否［10-11］。這些藥物在臨床使用中發(fā)揮著重要作用，但是長期服藥帶來的不良反應和給患者帶來的巨大的經(jīng)濟壓力有待解決。近年來中醫(yī)藥治療潰瘍性結腸炎的研究日益受到重視。根據(jù)中醫(yī)理論，方中黃芪、白術健脾益氣、燥濕、托毒生肌，茯苓利水滲濕，一健一滲，脾可健，濕可除，濕去則脾氣復來，陽氣易通；元胡，入心、脾、肝、肺，是活血化瘀、行氣止痛之妙品，尤以止痛之功效而著稱于世；黃連清熱燥濕、止痢養(yǎng)血，三七具有散瘀止血，消腫定痛之功效；柴胡有疏散退熱，升陽，舒肝之功能。藿香性味辛、微溫，入脾、胃、肺經(jīng)，有芳香化濕、和中止嘔、解暑發(fā)表之功，既可化在里之濕濁，又可解在表之暑濕；白芍味酸斂肝止瀉，防風舒肝散脾，能散氣滯。白術合甘草有理中之意；合白芍、甘草又有小建中湯溫中補虛、緩急止痛之義?，F(xiàn)代醫(yī)學亦證實，白術、白芍、黃連等均有抗炎、抗病毒作用，從而有利于祛除本病的感染因素；白術能激發(fā)和提高低下的免疫功能，特別是黃連、白芍對網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)有提高其吞噬功能的作用。

MPO是中性粒細胞中的一種酶，可以通過測定MPO活性來判定中性粒細胞浸潤程度，MPO活性是評價中性粒細胞在組織中浸潤程度的可靠指標［11］。本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組MPO活性明顯高于正常對照組，結腸康和柳氮磺胺吡啶則可顯著降低結腸炎小鼠MPO活性，25.6 g/kg結腸康可以使其顯著恢復，進一步證實結腸康對惡唑酮誘導的潰瘍性結腸炎起到了一定的治療作用。生理劑量的NO對消化系統(tǒng)起重要的保護作用，但是NO產(chǎn)生過多或胃腸道平滑肌對其敏感性增強可導致潰瘍性結腸炎。NF-KB、IL-6、IL-8、IFN-γ等細胞因子能刺激炎性細胞誘導iNOS蛋白表達上調(diào)產(chǎn)生大量NO，參與炎癥反應。NO既是免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用不可缺少的調(diào)節(jié)因子，又可由于過度產(chǎn)生導致組織損傷。NOS是NO合成的限速酶，檢測此酶可間接地反映NO的水平，iNOS主要通過生成NO而發(fā)揮其生物學作用。實驗結果提示，在潰瘍性結腸炎模型組iNOS表達增高，NO釋放量增加，NO、iNOS與MPO活性呈正相關，通過藥物治療后，結腸康各藥物治療組和柳氮磺胺吡啶治療組其NO、iNOS表達明顯下降，結腸康的作用呈明顯劑量依賴性，且其高劑量作用和柳氮磺胺吡啶無顯著差別，可使之恢復到正常水平。本結果進一步證實結腸康對惡唑酮誘導的潰瘍性結腸炎起到了一定的治療作用?？梢哉J為，NO的細胞毒作用及對免疫功能的影響與潰瘍性結腸炎的發(fā)病密切相關，但是因是果，目前尚不清楚，有待進一步研究。

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Effect of Jiechangkang on MPO，NO and iNOS of colitis mice induced by oxazolone

GUAN Li-hua1， GONG Yu-fang1， ZHANG Hong2， SHANG Ya-zhen1*

（1.Hebei Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research and Development/Institute of Traditional Chinese Medicine，Chengde Medical College，Chengde，067000，China；2.Hospital Affiliated to Chengde Medicl College，Chengde 067000，China）

AIMTo observe the effects of Jiechangkang（Astragali Radix，Atractylodis macrocephalae Rhizo-ma，Poria，Corydalis Rhizoma，Coptidis Rhizoma，Notoginseng Radix et Rhizoma，etc.）on myeloperoxidase（MPO）activity，nitric oxide（NO）level and inducible nitric oxide synthase（iNOS）protein expression of clone in oxazolone-induced ulcerative colitis mice.METHODSMice models were made by subcutaneous administration in cervix with a dose of 3%oxazolone and subsequently intragastric administration with 1.5%oxazolone on the sixth day after sensitization.Simultaneously，the oral administration began.The MPO activity and NO level were determined by spectrophotometry and the protein expression of iNOS was measured with immunohistochemistry method.Salazosulfapyridine was as positive control drug.RESULTSCompared with the control group，the MPO activity，NO level and iNOS protein expression significantly increased（P＜0.01）in colon of ulcerative colitis mice induced by oxazolone.However，the increases of MPO activity，NO level and iNOS protein expression were partly reversed by three doses of 6.4，12.8 and 25.6 g/kg Jiechangkang.Salazosulfapyridine group had the similar results.CONCLUSIONThe study reveals that Jiechangkang has certain effects on MPO，NO and iNOS，and may be helpful for treatment of ulcerative colitis.

Jiechangkang；ulcerative colitis；myeloperoxidase（MPO）；nitric oxide（NO）；inducible nitric oxide synthase（iNOS）

R285.5

A

1001-1528（2013）04-0669-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.04.007

2012-11-27

河北省高等學?？茖W技術研究青年基金項目 （2011147）

關麗華，女，碩士，講師，主要從事中藥藥理學的研究。

*通信作者：商亞珍，女，研究員，主要從事中藥藥理學的研究。Tel：（0314）2290616，E-mail：shangyz1018@yahoo.com.cn