煙草抗PVYN突變株SN01的SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

李 杰，朱 丹，李 穎，安夢(mèng)楠，趙秀香，吳元華*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866；2.遼寧省撫順市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，遼寧 撫順 113006）

Sequence-related amplified polymorphism (SRAP)標(biāo)記技術(shù)是一種新型的基于 PCR的顯性標(biāo)記系統(tǒng)[1]，該技術(shù)利用獨(dú)特的雙引物對(duì)基因的open reading frames（ORFs）特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，與RAPD、SSR、AFLP等技術(shù)相比，SRAP技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、信息豐富等優(yōu)點(diǎn)，特別是對(duì)序列信息未知的物種研究提供了快捷簡(jiǎn)便的途徑。該技術(shù)已成功用于一些重要性狀的標(biāo)記、基因定位、遺傳圖譜的構(gòu)建和抗病基因相關(guān)方面研究[2-8]。

本研究室通過(guò)人工接種的方法從煙草品種NC89中篩選獲得了高抗馬鈴薯Y病毒脈壞死株系（Potato virus Y-vein necrosis strain，PVYN）的植株（暫定名為SN01），并對(duì)該突變株的抗病生理生化機(jī)制進(jìn)行了報(bào)道[9]。采用正交試驗(yàn)建立優(yōu)化的SRAP-PCR反應(yīng)體系，為進(jìn)一步研究其抗病基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

抗PVYN煙草突變株SN01的嫩葉于2012年7—9月采自沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒研究室。用于SRAP-PCR反應(yīng)的dNTPs、Taq DNA聚合酶、標(biāo)準(zhǔn)分子量（Maker）DL2000及新型植物DNA提取試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，Mg2+溶液和10×PCR buffer（Mg2+free）均購(gòu)于大連寶生物工程有限公司。SRAP引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table1 Sequence of primers

1.2 方法

1.2.1 煙草總 DNA的提取和濃度測(cè)定 煙草總DNA的提取使用北京天根生化科技有限公司的新型植物DNA提取試劑盒，用美國(guó)熱電集團(tuán)生產(chǎn)的NANODROP 1000核酸檢測(cè)儀檢測(cè)所提取煙草DNA的濃度與純度，并通過(guò)瓊脂糖電泳檢測(cè)總DNA純度。將提取到的DNA稀釋至30 ng/μL，置于-20 ℃冰箱保存以備使用。

1.2.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系的正交設(shè)計(jì) 采用L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系里主要的5個(gè)影響因素（dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物、DNA模板）設(shè)計(jì)正交優(yōu)化試驗(yàn)，所用引物為Me8和Em8（表1）。SRAP-PCR各因素的水平見(jiàn)表2，L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表3。反應(yīng)總體系為 20 μL，每管加入 2 μL 的 10×PCR buffer（Mg2+free），其他組分加入量見(jiàn)表3，最后用ddH2O補(bǔ)充至 20 μL。

表2 SRAP-PCR反應(yīng)因素和水平Table2 Factors and levels of SRAP-PCR reaction

表3 SRAP-PCR反應(yīng)中各因素水平L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table3 L16(45) orthogonal design of factors and levels for the SRAP-PCR

1.2.3 SRAP-PCR擴(kuò)增 按照L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)16個(gè)處理，重復(fù)2次。根據(jù)表3制備總體積為20 μL的PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；前 5 個(gè)循環(huán)為 94 ℃變性 45 s，34 ℃退火 45 s，72 ℃延伸1 min；后35個(gè)循環(huán)僅將退火溫度變?yōu)?7 ℃；循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳觀測(cè)。

1.2.4 退火溫度及循環(huán)次數(shù)的篩選 在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)SRAP反應(yīng)的退火溫度和循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化篩選試驗(yàn)。退火溫度梯度試驗(yàn)設(shè)計(jì) 11個(gè)梯度處理，即48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58 ℃。在退火溫度梯度試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了循環(huán)次數(shù)的篩選，設(shè)置了9個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)2次：（1）52 ℃，30循環(huán)；（2）55 ℃，30循環(huán)；（3）57 ℃，30 循環(huán)；（4）52 ℃，35 循環(huán)；（5）55 ℃，35 循環(huán)；（6）57 ℃，35 循環(huán)；（7）52 ℃，40循環(huán)；（8）55 ℃，40循環(huán)；（9）57 ℃，40循環(huán)。

2 結(jié) 果

2.1 基因組DNA的提取

基因組提取使用北京天根生化科技有限公司的新型植物DNA提取試劑盒，經(jīng)核酸檢測(cè)儀檢驗(yàn)結(jié)果表明，所提取基因組的OD值為1.8～2.0，并且濃度較高。通過(guò)瓊脂糖電泳進(jìn)一步檢測(cè)（圖1），點(diǎn)樣孔附近有明顯的亮帶聚集產(chǎn)生，并且沒(méi)有拖尾現(xiàn)象，表明所提取的基因組純度較好，質(zhì)量較高。

2.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系正交設(shè)計(jì)的優(yōu)化

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)按照表3的16個(gè)處理進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析（圖2），可以看出處理1、2沒(méi)有條帶；處理3、4、5、12、13、14、15、16條帶較少，清晰度較差；處理 8、9、10、11的條帶較多，且亮度和清晰度較好，其中以處理11效果最好。

圖2 正交試驗(yàn)SRAP-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of SRAP - PCR product by orthogonal experiment

參照張麗等[10]的統(tǒng)計(jì)方法，對(duì) 16個(gè)組合正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析（表4），從k值結(jié)果可以看出，dNTPs以k3最佳，Mg2+以k3最佳，Taq DNA聚合酶也以k3最佳，引物以k2最佳，模板DNA以k4最佳，即dNTPs 0.4 mmol/L，Mg2+2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶0.8 U，引物0.3 mmol/L，模板DNA 120 ng。該結(jié)果與處理11相近，僅在Taq DNA聚合酶水平略有差異，從而認(rèn)為處理11為最佳組合，即20 μL體系中，最佳加入量分別為：dNTPs（2.5 mmol/L）3.2 μL、Mg2+（25 mmol/L）1.6 μL、Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.16 μL、引物（10 μmol/L）0.6 μL、DNA模板120 ng。從R值的結(jié)果來(lái)看，dNTPs對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響最大，Taq DNA聚合酶和引物影響次之，模板DNA和Mg2+影響相比較弱。從擴(kuò)增結(jié)果較好的處理8、9、11看，模板DNA的量分別是30、60、120 ng，表明模板DNA的試用范圍較廣。

2.3 退火溫度及循環(huán)次數(shù)

退火溫度梯度試驗(yàn)設(shè)計(jì)11個(gè)處理即48～58 ℃。從圖3中可以看出，退火溫度的不同對(duì)SRAP擴(kuò)增條帶有較大影響，以處理5（52 ℃）、處理8（55 ℃）和處理10（57 ℃）條帶較亮，其中以處理10擴(kuò)增條帶豐富，亮度最佳。

表4 SRAP正交試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析Table4 Statistic result of orthogonal experiment

圖3 不同退火溫度對(duì)SRAP-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果的影響Fig.3 The electrophoresis results of SRAP - PCR product in different annealing temperatures affect

在對(duì)退火溫度篩選研究的基礎(chǔ)上，對(duì)循環(huán)次數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化篩選，循環(huán)次數(shù)由30次增加到40次，設(shè)置9個(gè)處理，重復(fù)2次。從圖4中可以看出，循環(huán)次數(shù)30次條帶幾乎沒(méi)有或者不亮，而在35次和40次時(shí)條帶較好。在不同溫度、循環(huán)次數(shù)相同時(shí)比較,溫度越高條帶越清晰，且擴(kuò)增條帶增多。但在相同溫度、不同循環(huán)次數(shù)比較時(shí)，30次和40次時(shí)條帶較弱或者模糊，35次時(shí)條帶較亮且多態(tài)性較好。從整個(gè)電泳結(jié)果來(lái)看，以處理3結(jié)果最好，即退火溫度57 ℃，循環(huán)次數(shù)35次。

3 討 論

圖4 同退火溫度和循環(huán)次數(shù)的SRAP-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis results of SRAP-PCR products with different annealing temperatures and cycles

SRAP-PCR的反應(yīng)體系不僅受到材料差異的影響，而且引物的不同、試驗(yàn)儀器的不同也會(huì)對(duì)反應(yīng)體系造成一定的影響。本試驗(yàn)中試驗(yàn)材料為突變株SN01，為研究突變株SN01的抗病基因，通過(guò)引物篩選選用條帶清晰且數(shù)量較多的引物組合，并在使用此引物的基礎(chǔ)上，對(duì)SRAP-PCR體系進(jìn)行優(yōu)化。PCR反應(yīng)體系的合適與否直接影響其擴(kuò)增的結(jié)果，目前對(duì) PCR體系優(yōu)化的方法以正交試驗(yàn)和單因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)較多，正交試驗(yàn)方法可以減少試驗(yàn)次數(shù)，縮短試驗(yàn)周期，降低研究成本，可迅速快捷的找到優(yōu)化的方案。單因素試驗(yàn)可直觀快速地明確各因素對(duì)PCR的影響，但忽略了各因素間的相互作用[11]。對(duì)于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果的分析，主要是直觀法和統(tǒng)計(jì)分析法兩種方法評(píng)價(jià)分析，這兩種方法都有一定的主觀性，在擴(kuò)增條帶結(jié)果統(tǒng)計(jì)過(guò)程中難免會(huì)有人為因素的影響。

在PCR反應(yīng)中，不同的引物在反應(yīng)中要求退火溫度也有所不同，退火溫度過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)影響到產(chǎn)物的產(chǎn)量或質(zhì)量，因此本試驗(yàn)在初步篩選引物后進(jìn)行了梯度退火實(shí)驗(yàn)，并對(duì)循環(huán)次數(shù)進(jìn)行了篩選，得到了最佳的PCR反應(yīng)體系。

4 結(jié) 論

本研究以煙草抗PVYN突變株SN01為材料，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其SRAP的反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，并且對(duì)退火溫度和循環(huán)次數(shù)進(jìn)行了篩選，得出煙草突變株SN01的SRAP最佳反應(yīng)體系dNTPs（2.5 mmol/L）3.2 μL、Mg2+（25 mmol/L）1.6 μL、Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.16 μL、引物（10 μmol/L）0.6 μL、DNA模板120 ng。SRAP-PCR的最佳反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；前5個(gè)循環(huán)為94 ℃變性45 s，34 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；后35個(gè)循環(huán)將退火溫度變?yōu)?7 ℃；循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。該優(yōu)化體系的建立，為進(jìn)一步對(duì)煙草PVYN突變株SN01的抗病基因研究提供了可靠的基礎(chǔ)。

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