小強度跑臺運動對小鼠空間學習記憶及海馬糖原合成酶激酶-3β的影響①

劉慧莉，趙剛

·基礎研究·

小強度跑臺運動對小鼠空間學習記憶及海馬糖原合成酶激酶-3β的影響①

劉慧莉，趙剛

目的 觀察小強度跑臺運動對小鼠空間學習記憶能力及海馬糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)蛋白及基因表達的影響。方法3月齡雌性C57BL/6J小鼠24只，分為運動組(n=12)與對照組(n=12)。5個月后行Morris水迷宮測試及GSK-3β檢測。結果運動組小鼠逃避潛伏期短于對照組(P＜0.05)，尋找平臺路徑長度短于對照組(P＜0.05)，穿環(huán)次數(shù)多于對照組(P＜0.05)；運動組小鼠GSK-3β mRNA表達水平低于對照組(P＜0.05)，p-GSK-3β-Ser9/GSK-3β比值高于對照組(P＜0.05)。結論小強度跑臺運動可提高小鼠空間學習和記憶能力，降低GSK-3β活性可能是其健腦作用的分子機制之一。

跑臺運動；空間學習記憶功能；糖原合成酶激酶-3β；小鼠

[本文著錄格式]劉慧莉，趙剛.小強度跑臺運動對小鼠空間學習記憶及海馬糖原合成酶激酶-3β的影響[J].中國康復理論與實踐,2013,19(11):1016-1019.

運動作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效的刺激形式，能夠促進大腦的功能重組和代償。眾多研究表明，規(guī)律運動能提高認知功能[1-4]。運動形式是影響運動效果的重要因素之一。嚙齒類動物實驗研究中最常采用的運動形式為跑臺運動及跑輪運動，跑臺運動作為一種被動運動形式，能準確限定運動強度、時間、頻度，更接近于人類運動處方的執(zhí)行模式。

糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3, GSK-3)是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是參與糖代謝的主要限速酶之一，可使糖原合成酶磷酸化而抑制糖原合成。除參與糖代謝調節(jié)外，GSK-3還參與細胞增殖、分化和凋亡等。GSK-3主要有兩種亞型：GSK-3α和GSK-3β。GSK-3β在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都有表達，特別在海馬表達水平更高[5]。研究顯示，GSK-3β參與海馬突觸可塑性的調節(jié)[6-7]。海馬中GSK-3β的激活與記憶的形成相關[8]。

本研究觀察小強度跑臺運動對C57BL/6J小鼠空間學習記憶能力及海馬組織中GSK-3β蛋白表達及基因表達的影響，為制定運動處方提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 3月齡雌性C57BL/6J小鼠24只，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，每籠4只，自由進食和飲水。每天光照12 h。飼養(yǎng)室溫度22～24℃，相對濕度40%～60%。實驗動物飼養(yǎng)及取材遵守實驗動物管理和保護的有關規(guī)定。

1.1.2 主要藥品及試劑 兔抗GSK-3β抗體、羊抗p-GSK-3β(Ser9)抗體：美國SANTA CRUZ BIOTECH-NOLOGY公司；實時逆轉錄聚合酶鏈反應(Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,real-time RT-PCR)試劑盒：SYBR Premix Ex TaqTM，Ta-KaRa大連寶生物工程有限公司；RT-PCR引物由Ta-KaRa大連寶生物工程有限公司設計合成。

1.1.3 主要儀器設備 小動物跑臺、Morris水迷宮：淮北正華生物儀器設備有限公司；超速低溫離心機：德國Heraus-Biofuge-Primo?；UV-260紫外分光光度計：日本島津公司；電泳儀、轉印槽：上海天能科技有限公司；BIO-RAD凝膠成像分析系統(tǒng)：美國BIO-RAD公司；LightCycler 48ⅡPCR儀：瑞士Roche公司。

1.2 實驗方法

小鼠分為對照組和運動組，每組12只。

運動組進行跑臺適應性訓練2 d，第1天5 m/min運動10 min，第2天8 m/min運動10 min。第3天開始正式運動，每天14:00后進行跑臺運動30 min：5 m/ min運動5 min，8 m/min運動5 min，11 m/min運動20 min。這一運動強度約為45%～55%最大攝氧量(VO2max)[9]。

每天運動結束后放回飼養(yǎng)籠中，自由進食飲水。每周運動5 d，休息2 d，持續(xù)5個月(從3月齡至8月齡)。所有動物均順利完成運動方案。

對照組置于靜止跑臺上，與運動組時間相同。

1.3 Morris水迷宮測試

5個月運動訓練后進行Morris水迷宮測試[10]。Morris水迷宮由圓形水池(直徑120 cm，高60 cm)、站臺(直徑8 cm)、影像追蹤系統(tǒng)構成，水深約30 cm，水中加入無毒的食用白色素，使池水渾濁呈乳白色，水溫維持在24℃。池壁標明“E、S、W、N”4個入水點，將水池等分為4個象限，平臺置于第Ⅳ象限中央。水池上方攝像頭與計算機相連，用ZH0065 Plus Image Analyzer記錄實驗過程中小鼠的運動行為。正式實驗開始前1 d，予小鼠適應性游泳訓練。

整個實驗過程分為定位航行實驗和空間探索實驗。定位航行實驗包括可視平臺實驗1 d和隱蔽平臺實驗6 d，實驗過程中，平臺位置保持不變。最后一次隱蔽平臺實驗結束24 h后進行空間探索實驗。

可視平臺實驗中，平臺超過水面0.5 cm，分別將小鼠從4個不同的入水點面向池壁投入水中，小鼠尋找平臺。當小鼠爬上平臺或時間到達60 s時，停止實驗。如果60 s內小鼠沒有找到平臺，則實驗者引導其爬到平臺上，并讓其停留10 s。

隱蔽平臺實驗中，平臺低于水面0.8 cm，每天分別從4個象限入水，隨機選取第1次入水的象限，連續(xù)6 d，方法與可視平臺實驗相同。每次間隔5～15 min。

通過影像跟蹤系統(tǒng)記錄小鼠尋找并爬上平臺所需時間即逃避潛伏期(escape latency)和路程即路徑長度(path length)，并根據(jù)小鼠在水中搜索平臺的游泳軌跡確定其每次的搜索策略。

空間探索實驗時，撤去水中平臺，把小鼠從第Ⅱ象限投入水中，記錄120 s內小鼠通過平臺位置的次數(shù)(cross times)和搜索平臺的游泳軌跡。

1.4 組織取材

Morris水迷宮實驗結束1周后取材。所有小鼠斷頭取腦，剝離海馬，一半海馬快速投入液氮速凍，-80℃冰箱保存，待行Western blotting檢測。另一半加入Trizol，-80℃冰箱保存，待行RT-PCR。

1.5 Western blotting

取冷凍的小鼠海馬組織稱重，小剪刀剪碎樣品(冰上操作)，1∶4加入蛋白裂解液，超聲粉碎，4℃裂解過夜，4℃12000 r/min低溫離心30 min，取上清，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，每管50 μg蛋白分裝，-80℃凍存待用。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，4℃轉膜過夜，5%BSA溶液室溫封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，ECL發(fā)光，凝膠圖像分析系統(tǒng)采圖、分析。

1.6 RT-PCR

總RNA提?。喝〕鰞龃娴暮ｑR組織，充分勻漿(冰上操作)，裂解組織細胞后，將勻漿液移至1.5 ml離心管中。加入氯仿200 μl，振蕩15 s，室溫孵育2～3 min，4℃12000 r/min離心15 min，取上清；加入等體積異丙醇，充分混勻，室溫孵育10 min，4℃12000 r/min離心10 min，棄上清；加入75%DEPC水配制的乙醇1 ml，輕輕洗滌管壁，4℃12000 r/min離心5 min，棄上清；室溫干燥，加入DEPC水50 μl，將沉淀溶解；吸取20 μl總RNA樣品，紫外分光光度計測260 nm及280 nm吸光度值，檢測提取RNA的質量及產(chǎn)量。剩余樣品-80℃冰箱保存。

cDNA合成：取總RNA 1 μl，配置成cDNA合成反應液10 μl(含5x PrimeScript Buffer 2 μl，Prime-Script RT Enzyme Mix I 0.5 μl，50 μmol/L Oligo dT Primer 0.5 μl，Random 6mer 0.5 μl，RNase free dH2O 5.5 μl)，37℃孵育15 min，85℃終止反應5 s，4℃保持，-20℃長期保存。

PCR擴增：反應體系20 μl(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10 μl，10 μmon/L PCR Forward Primer 0.8 μl，10 μmon/L PCR Reverse Primer 0.8 μl，cDNA溶液2 μl，dH2O 6.4 μl)，反應條件：初始循環(huán)，95℃5 min；擴增循環(huán)，95℃15 s，55℃15 s，72℃45 s，共40個循環(huán)；繪制溶解曲線：95℃15 s，60℃ 1 min，緩慢加熱到95℃15 s。

引物序列：

根據(jù)標準曲線，熒光定量PCR儀自動分析并計算結果，實時RT-PCR結果以Ct值表示，即PCR反應指數(shù)增長初期熒光信號跨越閾值時的反應循環(huán)數(shù)。相對定量采用比較Ct法：以β-actin基因為管家基因，ΔCt為目的基因和管家基因的Ct值差。ΔΔCt表示對照組與處理組間的ΔCt差異。

1.7 統(tǒng)計學分析

圖1 隱蔽平臺實驗兩組逃避潛伏期

圖2 隱蔽平臺實驗兩組尋找平臺路徑長度

采用SAS 8.1統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以(±s)表示，組間比較采用方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 Morris水迷宮

可視平臺實驗中，小鼠的逃避潛伏期對照組為(56.34±8.62)s，運動組為(55.67±6.58)s，無顯著性差異(F=0.43,P=0.5134)；路徑長度對照組為(842.59± 138.16)cm，運動組為(823.78±113.67)cm，無顯著性差異(F=1.25,P=0.2665)。

隱蔽平臺實驗中，兩組小鼠搜索平臺的逃避潛伏期和尋找平臺路徑長度均呈下降趨勢(圖1、圖2)。從第3天開始，運動組逃避潛伏期顯著短于對照組(F= 21.54,P=0.0001)；從第4天開始，運動組尋找平臺路徑長度顯著短于對照組(F=95.21,P=0.0001)。

空間探索實驗中，運動組通過平臺位置(6.78± 1.88)次，明顯多于對照組(3.94±1.45)次(F=13.75,P= 0.0012)。

2.2 RT-PCR

溶解曲線只顯示一個主波峰，表明PCR擴增的特異性較高，符合熒光定量PCR的技術要求。擴增曲線分析顯示樣本擴增效率良好。

運動組GSK-3β mRNA表達的ΔΔCt為(0.5601± 0.2152)，明顯低于對照組(-0.0014±0.2352)(F=18.61,P=0.0015)。

2.3 Western blotting

運動組p-GSK-3β-Ser9/GSK-3β比值較對照組顯著升高(F=232.37,P=0.001)。見圖3。

圖3 兩組p-GSK-3β-Ser9/GSK-3β比值

3 討論

跑臺訓練常常使用電刺激等手段，被認為是一種被動運動形式，可能會引起訓練動物的精神刺激，產(chǎn)生不良后果，因而很多實驗者采用主動運動的跑輪進行研究。但在實際制定運動處方中，我們經(jīng)常需要限定運動強度、運動時間、運動頻度等，來保證處方的安全性和有效性，這是跑輪運動無法代替的。本實驗采用小強度跑臺運動，在整個訓練過程中，小鼠輕松完成運動方案，并未使用電刺激等強迫運動手段。我們認為這種運動更接近人類的運動處方形式。

本研究顯示，經(jīng)過5個月的小強度跑臺運動，小鼠的空間學習記憶能力增強，與以往研究結果一致[1-4]。

作為GSK-3的一個亞型，GSK-3β在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都有表達。海馬中GSK-3β的激活與記憶的形成相關[8]。

GSK-3活性受多種機制調節(jié)，磷酸化是研究最多的調節(jié)方式之一。GSK-3β-Ser9和GSK-3β-Tyr216的磷酸化修飾是機體對GSK-3β活性調控的關鍵過程，磷酸化GSK-3β的Ser9可以導致其失活[12]。與之相反的是磷酸化GSK-3β的Thr216則能夠增加此酶的活性。我們利用p-GSK-3β-Ser9/GSK-3β比值反映GSK-3β的活性，p-GSK-3β-Ser 9/GSK-3β比值下降表示GSK-3β的活性升高[13]。

研究顯示，小強度跑臺運動抑制GSK-3β活性。實時定量RT-PCR結果也顯示，小強度跑臺運動使C57BL/6J小鼠GSK-3β mRNA表達水平降低。此前研究顯示，GSK-3β參與調控長期跑臺運動對小鼠學習和記憶的影響[14]，與本研究一致。

本研究顯示，5個月小強度跑臺運動能提高小鼠的空間學習記憶能力，同時伴有GSK-3β基因表達與蛋白表達降低。兩者之間可能存在一定聯(lián)系，需要進一步研究。本實驗采用的運動處方對于健腦運動處方的制定有一定參考意義。

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Effects of Low Intensity Treadmill Training on Spatial Learning and Memory and Expression of Glycogen Synthase Kinase-3β in Hippocampus in Mice

LIU Hui-li,ZHAO Gang.Department of Sport Medicine,China Medical University,Shenyang 110001,Liaoning, China

ObjectiveTo investigate the effects of low intensity treadmill training on spatial learning and memory and expression of glycogen synthase kinase-3β(GSK-3β)in hippocampus in mice.Methods24 female C57BL/6J mice of 3 months were assigned into control group(n=12)and exercise group(n=12).They were assessed with Morris Water Maze task 5 months after exercise.The GSK-3β protein and mRNA expressed in hippocampus were determined 1 week after the task.ResultsThe latency and path length to escape onto the hidden platform decreased in the exercise group(P＜0.05),while the cross times increased(P＜0.05)compared with the control group.The level of GSK-3β mRNA decreased(P＜0.05)and ratio of p-GSK-3β-Ser9 to GSK-3β increased(P＜0.05)as well.ConclusionLow intensity treadmill exercise may improve the spatial learning and memory in mice,which may down-regulate the expression and activity of GSK-3β.

treadmill exercise;spatial learning and memory;glycogen synthase kinase-3β;mice

R455

A

1006-9771(2013)11-1016-04

2013-04-08

2013-04-24)

國家自然科學基金(No.31100857)。

中國醫(yī)科大學運動醫(yī)學系，遼寧沈陽市110001。作者簡介：劉慧莉(1977-)，女，黑龍江伊春市人，博士，副教授，主要研究方向：運動與學習和記憶。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.11.005