急性心功能障礙大鼠心肌中BNP的表達(dá)

高衛(wèi)民 ，曹志鵬 ，米 麗 ，杜中波 ，前田 均 ，朱寶利 ，

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110001；2.太倉(cāng)市公安局，江蘇 太倉(cāng) 215400；3.日本大阪市立大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)教室，大阪 545-8585日本）

心源性猝死是最常見的死因之一，也是法醫(yī)病理學(xué)鑒定的任務(wù)之一。傳統(tǒng)的法醫(yī)病理學(xué)對(duì)心肌損傷的認(rèn)定主要集中在形態(tài)學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)。然而，一些心源性猝死的案件中引起猝死的病變或形態(tài)學(xué)指標(biāo)往往缺乏特異性，這類死亡可能與心功能障礙直接相關(guān)，例如一些心肌病、心律失常以及一些沒有明顯缺血性損傷的缺血性心肌病。因此，客觀評(píng)價(jià)死亡之前的心功能狀態(tài)能更好地闡明猝死的確切機(jī)制，尤其在缺乏典型形態(tài)學(xué)損傷的心源性猝死的案件中具有重要的法醫(yī)學(xué)意義[1-2]。

研究[3]表明，死后心包液中腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）與氮末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）濃度的比值與死前心功能狀態(tài)有很好的相關(guān)性，BNP濃度越高，死前的心功能障礙越嚴(yán)重，因此心包液中的BNP濃度能客觀反映死前心功能障礙的程度。然而心包液中BNP濃度的升高主要出現(xiàn)在慢性充血性心衰以及部分心肌梗死的案例中，而在一些由急性缺血性心肌病引起的猝死案例中，心包液中BNP則通常很低。由于BNP首先在心肌組織中合成，而后才到達(dá)心血和心包液。因此，本實(shí)驗(yàn)以大鼠心肌組織作為研究對(duì)象，研究大鼠急性心功能障礙時(shí)心肌組織中BNP表達(dá)的變化規(guī)律，探討心肌組織中BNP表達(dá)在急性心功能障礙的法醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

兔抗大鼠BNP多克隆抗體（AB1549，美國(guó)Millipore 公 司 ），ElivisionTMsuperHRP （Mouse/Rabbit）IHC試劑盒（KIT-9921，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（P0010S，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），預(yù)染蛋白marker（SM0671，立陶宛Ferments公司），大鼠BNP特異性ELISA試劑盒（美國(guó) R&D 公司），D9108A RNAiso Plus、DRR037S逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DRR081S SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time，日本 TaKaRa Biotechnology公司），ECL發(fā)光劑（SC-2048，美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司），PRISM?7500 Real-Time PCR System （美國(guó)AB公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量 300～350 g，手術(shù)前飼養(yǎng)1周，每天換墊料，飼養(yǎng)室保證空氣流通，維持正常的光照時(shí)間和黑暗時(shí)間。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型制作

參照文獻(xiàn)[4]制作急性心功能障礙動(dòng)物模型：術(shù)前以40mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后，氣管插管，將心電圖電極固定在大鼠肢體上，實(shí)驗(yàn)過程中全程監(jiān)測(cè)心電圖。胸骨右側(cè)第2肋間切口，分層打開胸腔，在主動(dòng)脈根部鈍性游離主動(dòng)脈，將內(nèi)徑為0.8mm的注射器針頭平行置于主動(dòng)脈上，用4號(hào)手術(shù)絲線將主動(dòng)脈和針頭一同結(jié)扎，然后緩慢將針頭撤出，關(guān)胸，分層縫合，青霉素抗感染，大鼠恢復(fù)自主呼吸后，拔出氣管插管。 術(shù)后 1、2、4、6、8、10、12h 各取 5 只大鼠分別檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，然后將大鼠斷頸處死，取心血以及左室前壁心肌組織，心肌組織分為3部分，分別作免疫組織化學(xué)、Western印跡法、實(shí)時(shí)RT-PCR分析。另取5只大鼠作為對(duì)照組，僅麻醉、氣管切開處理，不作開胸解剖。

模型成立后觀察血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括左室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室舒張末壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左室內(nèi)壓最大上升速率+dp/dtmax、左室內(nèi)壓最大下降速率-dp/dtmax。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色

左室前壁心肌組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作厚度為5μm切片。BNP多克隆抗體以1∶600稀釋，采用Elivision法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，具體步驟按照試劑盒使用說明書進(jìn)行，染色過程中另以抗體稀釋液代替一抗，作為陰性對(duì)照。

1.3.3 Western印跡法檢測(cè)

左室前壁心肌組織100 mg，加入組織-細(xì)胞裂解液，冰上勻漿，超聲破碎，4℃下以離心半徑9.35 cm，12 000 r/min，離心40 min。取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)印法100 mA 90min 轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，一抗（1∶600）、二抗（1∶2000）孵育后，加入ECL發(fā)光劑進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。凝膠成像系統(tǒng)對(duì)PVDF膜進(jìn)行成像，用Scion Image圖像分析軟件對(duì)所成像中蛋白條帶光密度進(jìn)行半定量分析。各組均以GAPDH為內(nèi)參照。

1.3.4 實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)

Trizol法提取心肌組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR引物參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行合成，引物序列見表1。各組以GAPDH作為內(nèi)參，實(shí)時(shí)RT-PCR結(jié)果由PRISM?7500 Real-Time PCR System自動(dòng)采集計(jì)算出BNP基因的相對(duì)含量，以相對(duì)含量的變化來反映BNP mRNA的變化。

表1 實(shí)時(shí)RT-PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用Oneway ANOVA進(jìn)行組間分析，數(shù)據(jù)由±s表示。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)

在實(shí)驗(yàn)過程中，1h組有3只大鼠、2～12h組各有2只大鼠死亡。

血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2，就大鼠心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比值（HW/BW）而言，除2h、10h組外，所有的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠的 LVSP、LVEDP、+dp/dtmax明顯升高，-dp/dtmax4～12 h明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2），表明該模型造成了心室射血分?jǐn)?shù)減少，成功導(dǎo)致了大鼠急性心功能障礙。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（圖1）

對(duì)照組大鼠多呈陰性染色。隨著心功能障礙持續(xù)時(shí)間增加，實(shí)驗(yàn)組大鼠陽(yáng)性著色不斷增強(qiáng)：1～2h主要表現(xiàn)為弱陽(yáng)性，部分心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒狀沉積物，周圍的心肌細(xì)胞則呈陰性著色；4～6h心肌細(xì)胞主要表現(xiàn)為陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞面積不斷增大，偶可見陰性著色細(xì)胞；10～12h大鼠心肌細(xì)胞表現(xiàn)為強(qiáng)陽(yáng)性，陰性細(xì)胞幾乎不可見。另外，對(duì)同一張切片而言，心內(nèi)膜側(cè)的染色強(qiáng)度往往比心外膜側(cè)強(qiáng)，從心內(nèi)膜向心外膜染色強(qiáng)度逐漸減弱。

表2 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù) （±s）

表2 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù) （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05

組別 n HW/BW/（mg/g） HR/（次/min） LVSP/mmHg LVEDP/mmHg +dp/dtmax/（mmHg/s） -dp/dtmax/（mmHg/s）對(duì)照 5 3.15±0.17 380±36 91.3±6.8 2.3±0.3 4327±172 4210±320 1h 2 3.82±0.53 470±54 152.7±7.21） 13.2±3.21） 6801±2471） 3817±282 2h 3 4.36±0.251） 376±23 170.4±7.81） 20.3±2.71） 7217±2611） 3904±274 4h 3 3.57±0.36 341±25 178.2±6.91） 23.2±2.51） 7632±2481） 3682±2411）6h 3 3.72±0.48 325±32 182.1±9.31） 25.8±3.71） 6482±2651） 2896±2631）8h 3 3.75±0.83 330±27 186.6±10.21） 28.9±3.41） 6570±2861） 2763±1831）10h 3 4.47±0.971） 305±20 175.3±8.71） 20.2±2.41） 4872±1621） 2409±1671）12h 3 3.85±0.74 360±38 169.7±7.51） 18.5±1.91） 4620±1571） 2382±1461）

圖1 BNP免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 Elivision×400

2.3 Western印跡法和實(shí)時(shí)RT-PCR結(jié)果

Western印跡法結(jié)果顯示，隨心功能障礙時(shí)間的持續(xù)，平均光密度呈升高趨勢(shì)，最大比值出現(xiàn)在10h，12h 開始下降（圖 2，表 3）。

實(shí)時(shí)RT-PCR結(jié)果顯示，BNP mRNA較BNP蛋白變化時(shí)間提前。急性心功能障礙后1h，大鼠心肌組織中BNP mRNA含量即達(dá)到對(duì)照組的3.4倍左右，而且BNP mRNA含量在6 h達(dá)到峰值，比BNP蛋白達(dá)到峰值的時(shí)間提前4h。6h后BNP mRNA含量呈下降趨勢(shì)（表3）。

圖2 Western印跡法結(jié)果

表3 大鼠急性心功能障礙后各時(shí)間段BNP蛋白平均光密度和BNP mRNA相對(duì)表達(dá)量（±s）

表3 大鼠急性心功能障礙后各時(shí)間段BNP蛋白平均光密度和BNP mRNA相對(duì)表達(dá)量（±s）

注：1）與對(duì)照組相比，P＜0.05；2）與相鄰上組相比，P＜0.05

組別 n 平均光密度 mRNA相對(duì)表達(dá)量對(duì)照 5 3.17±0.62 1 1h 2 21.60±1.241） 3.42±0.231）2h 3 42.38±1.721）2） 3.86±0.391）4h 3 55.04±2.191） 5.56±0.271）2）6h 3 61.70±2.981） 6.19±0.491）8h 3 83.92±3.281） 5.82±0.511）10h 3 95.71±2.761） 5.64±0.821）12h 3 75.30±2.971） 4.72±0.501）2）

2.4 心律失常致死大鼠心肌中BNP的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)過程中心電圖監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，心律失常是實(shí)驗(yàn)過程中大鼠死亡的主要原因，尤以室性心律失常為主。對(duì)這類死亡大鼠心肌組織中BNP的研究發(fā)現(xiàn)，除BNP mRNA較對(duì)照組明顯升高外，免疫組化染色結(jié)果和Western印跡法結(jié)果與對(duì)照組相比均沒有明顯差異。

3 討 論

BNP是心室容量負(fù)荷和壓力負(fù)荷增大時(shí)心肌細(xì)胞釋放的一種激素，機(jī)械性牽張是心肌細(xì)胞合成和分泌BNP的主要機(jī)制[6]。臨床研究[7]表明，血漿中BNP濃度與心室射血分?jǐn)?shù)具有相關(guān)性，心室射血分?jǐn)?shù)不足時(shí)，有效循環(huán)血量不足，大量的血液聚集在心室內(nèi)，導(dǎo)致心室壓力增大心室腔擴(kuò)張，從而引起B(yǎng)NP合成和釋放。因此，BNP是心臟容量負(fù)荷和壓力負(fù)荷增大的直接產(chǎn)物，任何因素導(dǎo)致心功能障礙、射血分?jǐn)?shù)低下，都會(huì)導(dǎo)致BNP合成和釋放增加，死后檢測(cè)BNP極有可能反映死亡之前的心功能狀態(tài)。特別對(duì)于沒有明顯心肌缺血或者梗死的案例，死后檢測(cè)BNP能較客觀地反映死前的心功能障礙存在，在法醫(yī)學(xué)上有重要的意義[8]。本實(shí)驗(yàn)表明大鼠主動(dòng)脈縮窄后，血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)包括LVSP、LVEDP、+dp/dtmax都明顯升高，表明心臟射血分?jǐn)?shù)明顯減小，心功能障礙模型建立。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠隨著心功能障礙持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，染色強(qiáng)度從心內(nèi)膜向心外膜逐漸減弱，對(duì)照組染色結(jié)果為陰性。2h內(nèi)的染色以弱陽(yáng)性為主，6h以后逐漸增強(qiáng)，呈陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性，進(jìn)一步證實(shí)了BNP是反映心臟血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷增大時(shí)的應(yīng)急和敏感指標(biāo)[9]，可見心功能障礙可以通過BNP的免疫組織化學(xué)染色顯示出來，染色強(qiáng)度能反映心功能障礙的持續(xù)時(shí)間。BNP蛋白定量檢測(cè)結(jié)果顯示，心肌組織中BNP濃度與心功能障礙持續(xù)時(shí)間有良好的相關(guān)性。

為探索早期BNP基因的表達(dá)，本研究同時(shí)也檢測(cè)了BNP mRNA的含量變化。結(jié)果表明急性心功能障礙后1h即能檢測(cè)到BNP mRNA顯著升高。關(guān)于大鼠急性心肌梗死模型中心肌組織BNP的表達(dá)規(guī)律早有報(bào)道。徐永城等[10]的研究表明，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支3h后，心肌組織中BNP mRNA才開始升高；Hama等[11]發(fā)現(xiàn)，阻斷心肌血流4 h后，左心室心肌中BNP mRNA的濃度明顯高于對(duì)照組。與先前的研究結(jié)果不同，本研究大鼠急性心功能障礙模型中，手術(shù)后1 h即能檢測(cè)到明顯的BNP mRNA升高，比上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)間要早。另外，心功能處于代償期的時(shí)候，并不會(huì)引起B(yǎng)NP基因表達(dá)的上調(diào)，只有處于失代償性心功能障礙時(shí)BNP基因的表達(dá)才會(huì)增加，表明BNP是心功能從代償期到失代償期過渡的標(biāo)志物[12]，所以完全可以解釋為何心肌梗死3～4 h后才能檢測(cè)到BNP mRNA明顯升高這一結(jié)果?？紤]到正常心肌組織中基本沒有或者只含有少量的BNP蛋白和mRNA，只有心肌細(xì)胞存在機(jī)械性牽拉時(shí)才會(huì)刺激BNP的合成和分泌，故BNP mRNA是急性心功能障礙時(shí)心室容量負(fù)荷和壓力負(fù)荷增大，心室壁牽張信息的儲(chǔ)存體，尤其當(dāng)瀕死期很短時(shí)，BNP蛋白尚未合成和分泌，此時(shí)BNP mRNA的檢測(cè)將有助于解釋死亡時(shí)的微觀病理生理過程[13]。

研究心功能障礙時(shí)BNP的表達(dá)規(guī)律對(duì)一些由缺血性心臟病導(dǎo)致心源性猝死的認(rèn)定有一定的意義。在這些猝死的案件中，系統(tǒng)的法醫(yī)學(xué)解剖往往檢測(cè)不到急性心肌梗死或者明顯的冠狀動(dòng)脈狹窄或者冠狀動(dòng)脈血栓形成，其中有一些冠狀動(dòng)脈病變很輕微，冠狀動(dòng)脈狹窄不超過Ⅱ級(jí)；而且在一些高度懷疑為缺血性心臟病致死的案件中，即使使用實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)都找不到明顯的缺血性損傷的證據(jù)[14]。就急性心肌缺血而言，筆者認(rèn)為，單純依據(jù)尸檢時(shí)檢測(cè)到輕微或局部的缺血性改變不足以準(zhǔn)確闡明猝死的確切機(jī)制和病理生理過程；急性心肌缺血往往只有引起急性心律失?；蛘邍?yán)重影響心室射血功能時(shí)才可能導(dǎo)致猝死，因此，在得出缺血性心臟病導(dǎo)致猝死的鑒定結(jié)論之前有必要客觀評(píng)價(jià)死亡之前的心功能狀態(tài)，結(jié)合本研究結(jié)果可以推測(cè)檢測(cè)心肌組織中BNP的表達(dá)情況對(duì)此類案件的診斷具有一定的參考價(jià)值。

另外，臨床研究[15-16]表明，心律失常，尤其是室性心律失常（ventricular arrhythmias，VA）是心源性猝死的主要致死原因。本實(shí)驗(yàn)心電圖檢測(cè)結(jié)果表明，心功能障礙時(shí)常伴有各種心律失常發(fā)生，主要表現(xiàn)為室性心動(dòng)過速和室顫，且心律失常死亡大鼠BNP mRNA明顯升高。心律失常發(fā)生時(shí)往往導(dǎo)致心室射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）降低，有效循環(huán)血量不足，心室過度充盈擴(kuò)張，必然導(dǎo)致心肌細(xì)胞合成和釋放BNP增加。很多研究[17-20]均表明BNP是預(yù)測(cè)住院病人發(fā)生心律失常及預(yù)后和死亡率的強(qiáng)有力的指標(biāo)，可見心肌組織中BNP與心律失?？赡苡忻芮械年P(guān)系。

本研究結(jié)果表明，增加左心室后負(fù)荷造成急性心功能障礙后大鼠心肌組織中BNP、BNP mRNA的表達(dá)明顯升高，且具有一定的時(shí)間規(guī)律性。檢測(cè)心肌組織中BNP蛋白及BNP mRNA的表達(dá)可為法醫(yī)病理學(xué)者客觀評(píng)價(jià)心功能狀態(tài)提供一種新的途徑。

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