一種來源于植物內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的抗腫瘤活性研究

胡淑媛 羅都強 陳 川

1.河北大學生命科學學院，河北 保定 071000；2.河北大學藥物化學與分子診斷重點實驗室，河北 保定 071000；3.河北大學生命科學學院，河北 保定 071000

天然產(chǎn)物及其衍生物一直是寶貴的化學預防和治療藥物的來源，它們主要來源于微生物，植物和動物體內(nèi)的組成成分或其代謝產(chǎn)物。最近從植物內(nèi)生真菌中分離的天然產(chǎn)物引起了人們的重視。細胞凋亡是一個受到嚴格控制的自我毀滅的過程，維持著細胞的動態(tài)平衡。細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導通路的異常，這導致的癌癥的發(fā)生。促進細胞凋亡和抑制癌細胞增殖的化合物，被認為是潛在的抗癌藥物。

DMMP (4-(3'，3'-dimethylallyloxy)-5-methyl-6-methoxyphthalide) 最早分離自蔥鏈格孢（Alternaria porri），結(jié)構(gòu)見圖1。楊小龍等人從植物內(nèi)生真菌石楠擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis photiniae）中同樣也分離到，并發(fā)現(xiàn)有一定的抗真菌活性[1]。我們分離得到DMMP并對其抗腫瘤機制進行了研究發(fā)現(xiàn)，DMMP可以抑制HeLa的增殖并誘導其凋亡。

圖1 DMMP的結(jié)構(gòu)

1 實驗材料及方法

DMMP由本實驗組分離得到（純度＞ 99%，HPLC 純），人宮頸癌細胞系HeLa細胞系從中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學細胞中心購買，DMEM細胞培養(yǎng)基（GIBCO）。

1.1 MTT法檢測DMMP抗腫瘤活性

對數(shù)期的HeLa細胞8000個/·孔接種于96孔板中，37℃、5%C O2培養(yǎng)24h后加入D M S O溶解的D M M P，使其終濃度分別為0μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，80μg/mL。藥物分別作用24h、48 h、72 h后，加入20μL 5mg/mL的MT ，37℃、5%CO2孵育4 h，加入100μL 10%SDS-HCl，繼續(xù)孵育過夜。在酶標儀上于570 nm處讀取OD值，計算藥物對細胞的抑制率。抑制率=[（OD對照組-OD藥物處理組）/OD對照組]×100%。

1.2 DAPI染色檢測細胞核形態(tài)變化

對數(shù)期的HeLa細胞10000個/·孔接種于24孔板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h，加入DMMP，終濃度為40μg/mL，分別培養(yǎng)12 h，24h。然后除去培養(yǎng)基，PBS洗三遍，4%多聚甲醛固定10min后PBS洗三遍。1μg/mL的DA PI染液避光染色5min，PBS清洗后，于熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)變化。

1.3 Western blot檢測蛋白變化

六孔板內(nèi)接種5×105個細胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h，分別用終濃度為0μg/·mL、30μg/·mL、40μg/·mL和50μg/·mL的DMMP處理細胞24h。胰酶消化收集所有細胞，計數(shù)。用細胞裂解液（50mm Hepes-NaOH，100mm NaCl，0.5% NP-40，2.5mm EDTA，10% 甘油，1mm DTT，1mm PMSF，0.7μL/mL胃酶抑制劑，0.5μL/mL 亮抑酶肽，2μg/mL 抑肽酶）裂解細胞后，12000 rpm、4℃離心15min，取上清，得總蛋白。利用Bradford法做蛋白濃度標準曲線，測出樣品蛋白濃度。上樣50μg總蛋白，進行Western印記，檢測P73、P27的蛋白變化，GAPDH蛋白作為內(nèi)參。

1.4 實時熒光定量PCR（Real time PCR）檢測相關基因mRNA水平的變化

六孔板內(nèi)接種5×105個細胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h，用40μg·/mL DMMP分別處理細胞0 h、12 h、24h和36 h。處理后的所有細胞，Trizol 處理提取總RNA。測定總RNA的量，然后將R NA定量進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，檢測不同基因的變化，以GAPDH基因為內(nèi)參，每組做3個平行。所得數(shù)據(jù)利用ΔΔCT方法計算基因表達量的變化。

2 實驗結(jié)果

2.1 DMMP抑制HeLa細胞增殖

DMMP對HeLa的抑制率結(jié)果見圖2A。不同時間的IC50分別為24h：36μg/mL；48 h：22μg/mL；72 h：13μg/mL，隨著藥物濃度的升高，抑制率不斷升高。結(jié)果證明DMMP抑制HeLa細胞增殖具有劑量和時間依賴性。

圖2 DMMP抑制HeLa細胞增殖

DM M P處理HeLa細胞后， DA PI熒光染色見圖2B，處理12h后細胞核出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮，細胞核碎裂，被染成大小不一、致密濃染的顆粒，證明開始有細胞凋亡；處理24h后凋亡小體數(shù)目增多。

2.2 不同藥物濃度的處理后P73，P27蛋白的變化

P27是一種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，可使細胞周期停滯于G1期，從而抑制細胞增殖。經(jīng)不同藥物濃度處理HeLa細胞，發(fā)現(xiàn)P27蛋白的表達量有一定的升高。P73是抑癌基因蛋白P53的類似物，能轉(zhuǎn)錄激活幾乎所有P53的調(diào)節(jié)基因，與細胞的凋亡相關。DMMP能顯著地增加P73蛋白的水平。見圖3。

圖3 不同藥物濃度的處理后P73、P27蛋白的變化

2.3 DMMP處理后p73，JunB，p16，F(xiàn)KHR，Bim的mRNA表達水平

JunB是一種p73調(diào)節(jié)基因，通過誘導細胞周期蛋白依賴性激酶CDKs（Cyclin-dpendent kinase）抑制劑p16來抑制細胞的增殖。經(jīng)DM M P不同時間處理HeL a細胞后，發(fā)現(xiàn)p73的m R NA在36 h顯著增加，是對照的2.6倍。JunB的mRNA在藥物處理12 h就顯著升高并且逐步升高，到36 h時是對照的7.6倍，見圖4。p16的mRNA在12 h時開始增加，24h是對照的4.6倍，隨后回落到對照的2.2倍，具有顯著差異。

圖4 p73、JunB、p16、FKHR和Bim的mRNA表達水平

表1 Real time PCR中用到的引物

FKHR（The FOXO family of Forkhead transcription factors 1，F(xiàn)OXO1）受PI3K/Akt 通路的調(diào)節(jié)，對某些促凋亡基因如Bim有調(diào)節(jié)作用，進而誘導細胞凋亡。DMMP能顯著的增加FKHR的mRNA水平，在12 h時達到最高3.3倍。Bim的mRNA變化趨勢與FKHR及其相似，都是在12 h時有顯著升高。

3 討論

使用DAPI染色分析發(fā)現(xiàn)DMMP可以誘導HeLa細胞出現(xiàn)典型的細胞凋亡形態(tài)，如細胞漿濃縮，細胞體積縮小；細胞核固縮進而斷裂為大小不一的片段，細胞變成數(shù)個凋亡小體。

細胞周期進程是由CDKs所觸發(fā)的，它除了受Cyclins正向調(diào)節(jié)外，還受到另一類蛋白質(zhì)的負向調(diào)控，這類蛋白稱為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑CKIs（CDK inhibitors），可分為兩類一類是INK4的家族（p16INK4a的，P15INK4B，p18INK4c和p19INK4d的），第二類是CIP/ KIP家族（p21CIP1和p27KIP1）。DM M P處理HeLa細胞后，p27KIP1蛋白和p16IN K4a的m R NA的水平的升高。

DMMP處理后能顯著的增加P73蛋白的表達，我們隨后對其mRNA和其調(diào)控基因JunB進行了分析。JunB是p73的一個靶基因，是增殖的負調(diào)節(jié)因子，它已被證明在成纖維細胞中誘導p16的轉(zhuǎn)錄。失去JunB表達的轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)慢性髓性白血病，表明在髓樣細胞中JunB是一種腫瘤抑制基因[2]。在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)DMMP處理后p73，JunB和p16的mRNA水平都有不同程度的升高，說明p73-JunB-p16通路可能與DMMP誘導的細胞周期阻滯相關。

叉頭轉(zhuǎn)錄因子FKHR（FOXO1）在細胞內(nèi)主要受PI3K/Akt的負向調(diào)控，過表達F K H R可以誘導細胞周期阻滯和凋亡。FKHR可以轉(zhuǎn)錄激活P27蛋白而使細胞周期停滯在G1期。其促凋亡作用可以通過轉(zhuǎn)錄激活FasL、Bim和Bcl-6等促進凋亡的蛋白來實現(xiàn)[3]。在實驗中發(fā)現(xiàn)，藥物處理后P27蛋白表達有一定的增高。定量PCR發(fā)現(xiàn)FK HR的m R NA水平在DM M P作用后有顯著的升高，并且其調(diào)控的Bim基因的表達也有顯著的增加。Bim是唯BH3域蛋白（BH3-only proteins），在凋亡的啟動及凋亡通路中發(fā)揮著極其重要的作用。Bim可以直接與Bax等相互作用并共同轉(zhuǎn)位到線粒體膜上引起細胞色素C釋放而誘導凋亡。DMMP能引起B(yǎng)im的mRNA增多，這提示著DMMP可能通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。有報道發(fā)現(xiàn)P73能夠調(diào)節(jié)Akt-FKHR-Bim 通路并誘導細胞凋亡。P73與Akt- FKHR-Bim通路的作用是否與DMMP誘導細胞凋亡有關還需要進一步實驗研究。

總之，DMMP能顯著的抑制HeLa細胞的生長，其作用機制可能與其上調(diào)p73和FKHR轉(zhuǎn)錄因子導致JunB，p16，F(xiàn)KHR和Bim基因的mRNA增高相關。

[1]Yang XL，Zhang S，Hu QB，et al.Zhang Y（2011）Phthalide derivatives with antifungal activities against the plant pathogens isolated from the liquid culture of Pestalotiopsis photiniae[J]. JAntibiot（Tokyo），64：723.

[2]萬虹，石原弘.X射線照射誘導小鼠junB基因的表達[J].中華放射醫(yī)學與防護雜志，2004（4）：309-321.

[3]Boudewijn M.T.Burgering and Geert J.P.L.Kops.Cell cycle and death control：long live Forkheads TRENDS in Biochemical Sciences，2002，27（7）.