Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素構(gòu)效關(guān)系的研究進(jìn)展

劉文麗，張?zhí)m威，* ，John shi，易華西

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090;2.加拿大農(nóng)業(yè)部圭爾夫食品研究中心，安大略省圭爾夫N1G5C9)

近年來，隨著涉及食品病原菌和腐敗菌的食品安全事故頻繁爆發(fā)，人們越來越關(guān)注食品安全問題［1］。利用乳酸菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)尤其是細(xì)菌素來抑制食品腐敗菌和致病菌越來越得到人們的認(rèn)同，乳酸菌細(xì)菌素是乳酸菌在代謝過程中由核糖體產(chǎn)生的多肽。Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素是一類乳酸菌產(chǎn)生的具有N端保守序列YGNGVXCXXXXCXV，包括形成二硫鍵的Cys且對李斯特氏菌具有強(qiáng)烈抗菌活性的非羊毛硫氨酸修飾的熱穩(wěn)定性多肽［2］，與其它細(xì)菌素相比，由于Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素對食品典型的致病菌李斯特氏菌具有更強(qiáng)的抗菌活性和更好的物理化學(xué)性質(zhì)，因此目前被認(rèn)為是很有發(fā)展前途的細(xì)菌素［3－5］。為了能更深入地了解Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素，使其更有利于應(yīng)用于食品工業(yè)，深入了解乳酸菌細(xì)菌素結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系是必要的。Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素構(gòu)效關(guān)系的研究現(xiàn)在涉及到的主要有細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)域及結(jié)構(gòu)模型、Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素對目標(biāo)指示菌細(xì)胞膜的作用過程、細(xì)菌素各結(jié)構(gòu)域與細(xì)菌素抗菌活性的關(guān)系，下面分別進(jìn)行陳述。

1 Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)域及結(jié)構(gòu)模型

通過對近年來Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素構(gòu)效關(guān)系研究的總結(jié)［6－9］，預(yù)測Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)域可能是由N端保守序列YGNGV形成的β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)、N端β折疊形成的親水性N端、中間區(qū)域形成的親水或兩親性α螺旋、C端疏水區(qū)域形成的兩親性α螺旋組成［6－9］(如圖 1a)，這些結(jié)構(gòu)域連在一起就組成了Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)模型。

2 Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素對目標(biāo)指示菌細(xì)胞膜的作用過程

Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素對目標(biāo)指示菌細(xì)胞膜的作用過程主要分為兩步。第一步主要是Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素通過靜電作用與目標(biāo)指示菌結(jié)合(如圖1b)，由于Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的N端β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，使N端保守序列YGNGV很容易暴露并被假想的目標(biāo)指示菌的細(xì)胞膜表面(膜結(jié)合受體分子)識別，這將能夠使Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素在目標(biāo)膜表面正確的定位(如圖1b①)。細(xì)菌素正確定位后，Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的β折疊通過靜電作用與膜結(jié)合受體分子結(jié)合，這就使Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的β轉(zhuǎn)角和β折疊都與膜結(jié)合受體分子結(jié)合(如圖1b②)。第二步，如圖1C，Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的中間區(qū)域的傾斜α螺旋和C端疏水區(qū)域兩親性α螺旋通過疏水作用與膜結(jié)合受體分子結(jié)合，使整個(gè)Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素都與膜結(jié)合受體分子結(jié)合(如圖1C③)，由于C端疏水性比N端強(qiáng)，因此大多數(shù)情況下，Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素是通過C端和目標(biāo)細(xì)胞膜的疏水相互作用，而使Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素重新定位和插入膜內(nèi)部，這樣兩個(gè)Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素共同作用目標(biāo)指示菌細(xì)胞膜，就使目標(biāo)指示菌細(xì)胞膜內(nèi)組分被泄露或溢出，從而促成孔洞的形成;極少數(shù)情況下，Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的N端在膜結(jié)合受體分子的兩側(cè)相同的位點(diǎn)共同作用，然后，兩側(cè)的C端同時(shí)通過疏水作用重新定位和插入目標(biāo)指示菌細(xì)胞膜內(nèi)，從而同樣導(dǎo)致目標(biāo)指示菌細(xì)胞膜內(nèi)組分被泄露或溢出，形成孔洞(如圖1C④)。

3 Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素各結(jié)構(gòu)域與抗菌活性的關(guān)系

3.1 Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素N端保守序列YGNGV與抗菌活性的關(guān)系

一種假說認(rèn)為保守序列YGNGV可能與Ⅱa類細(xì)菌素的作用機(jī)制的識別步驟有關(guān)［10］，與作用的專一性無關(guān)［6］，這一假說還沒有明確的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，但替換和刪除保守序列YGNGV對Ⅱa類細(xì)菌素抑制李斯特活性的影響卻有確切報(bào)道。Fleury Y等［11］為了研究mesentericinY10537N端保守序列與mesentericin Y 10537抗李斯特活性的關(guān)系，通過酶水解或固相合成刪除N端，結(jié)果顯示刪除N端將導(dǎo)致細(xì)菌素降低10000倍的抗李斯特活性。Quadri等［12］對 CarnobacteriumpiscicolaLV17B產(chǎn) 生的Carnobacteriocin B2的48個(gè)氨基酸序列的第3、33、34、37、46位的氨基酸替換，將第28位氨基酸刪除，研究結(jié)果表明對細(xì)菌素的氨基酸序列進(jìn)行較小的變動(dòng)都會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌素抗菌活性的消失和很大程度的降低，細(xì)菌素產(chǎn)量也會(huì)受到很大影響，特別是 N端。Miller等［13］通過測定Ⅱa類細(xì)菌素pediocin AcH合成和分泌的最小需要，結(jié)果表明Ⅱa類細(xì)菌素pediocin AcH N端并沒有橫跨膜結(jié)合受體分子，但N端保守序列 Lys+1－Tyr－Tyr－Gly－Asn－Gly－Val+7－對pediocin AcH是非常重要的，因?yàn)閯h除這個(gè)序列，pediocin AcH的抗菌活性消失。Jitka Rihakova等［14］利用單個(gè)氨基酸替換產(chǎn)生單氨酸替換突變體，并利用合成基因在大腸桿菌中表達(dá)，從而產(chǎn)生一個(gè)重組的細(xì)菌素DvnRV41，這個(gè)重組的細(xì)菌素在N端區(qū)域具有4個(gè)額外的氨基酸，原因是利用酶水解并保持原有細(xì)菌素DvnV41的抗菌活性，為了了解DvnV41的構(gòu)效關(guān)系，Jitka Rihakova利用單個(gè)氨基酸替換保守序列中的氨基酸或者C端的氨基酸，從而產(chǎn)生8株單氨酸替換突變體，來研究Ⅱa類細(xì)菌素DvnV41的構(gòu)效關(guān)系，研究結(jié)果表明替換保守序列中的氨基酸將降低Divercin V41對李斯特氏菌的抗菌活性。此外，Ⅱa類細(xì)菌素除了具有典型的保守序列YGNGV，有的還是 YGNGV和 YGNGL，例如，Tomita H等［15］比較了Enterococcus faecalis YI717產(chǎn)生保守序列為YGNGL的bacteriocin 31與保守序列為YGNGV的其它Ⅱa類細(xì)菌素氨基酸序列的相似性進(jìn)行比較，結(jié)果表明Ⅱa類細(xì)菌素的N端序列具有高度的相似性，表明N端保守序列對Ⅱa類細(xì)菌素的抗菌活性有重 要 影 響。Kanatani K 等［16］對 Lactobacillus acidophilusTK9201產(chǎn)生的細(xì)菌素 acidocinA(YGTNGV)的研究結(jié)果表明Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的保守序列對細(xì)菌素的抗李斯特活性有影響。因此，刪除或替換YGNGV保守序列將擾亂β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和N端β折疊結(jié)構(gòu)，最終影響的不僅是抑制李斯特氏菌的活性，還包括對其它目標(biāo)指示菌的抗菌活性。

3.2 N端親水β折疊與抗菌活性的關(guān)系

N端β折疊結(jié)構(gòu)使Ⅱa類細(xì)菌素具有兩親特性，使細(xì)菌素和膜表面通過靜電作用進(jìn)行細(xì)菌素對膜的識別步驟(如圖1b②)。這個(gè)假說已經(jīng)被chen等［3］所證實(shí)，他的研究結(jié)果表明pediocin PA－1的N端β折疊的親水片段 Lys－1，Lys－11 and His－12，是用來調(diào)節(jié)細(xì)菌素與目標(biāo)指示菌細(xì)胞膜作用的，而位于pediocinPA－1發(fā)夾環(huán)的尖端的疏水片段 Val－7，Cys－9和 Cys－14，Val－16 和 Trp－18 主要是用來調(diào)節(jié)細(xì)菌素插入目標(biāo)指示菌細(xì)胞膜的過程。Havarstein，L.S等［17］、Miller，K.W 等［18］和 Quadri，L.E.N 等［12］的研究結(jié)果表明，不具有 N端延伸、具有前導(dǎo)肽prebacteriocins或者具有麥芽糖結(jié)合蛋白 MBP－pediocin AcH的Ⅱa類細(xì)菌素N端部分并沒有插入目標(biāo)菌株細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，且和成熟肽相比，前導(dǎo)肽的活性是非常弱的，可能是因?yàn)榍皩?dǎo)肽干涉了細(xì)菌素和膜的結(jié)合。這些研究都支持了N端β折疊結(jié)構(gòu)涉及了細(xì)菌素和膜表面通過靜電作用進(jìn)行細(xì)菌素對膜的識別步驟。Deegan 等［19］和 Kazazic 等［20］也證實(shí)了帶電荷的親水N端β折疊結(jié)構(gòu)通過靜電作用與目標(biāo)指示菌細(xì)胞膜上的帶陰離子磷脂頭部的極性殘基結(jié)合。

3.3 中心區(qū)域形成的親水或兩親傾斜α螺旋與抗菌活性的關(guān)系

Ⅱa類細(xì)菌素中心區(qū)域的傾斜α螺旋主要涉及細(xì)菌素對目標(biāo)膜受體分子的重新定位和插入功能，如圖1C③。對于這一假說觀點(diǎn)的研究支持，目前報(bào)道較少。Bennik等［21］的研究結(jié)果表明九個(gè)Ⅱa類細(xì)菌素都擁有傾斜的α螺旋結(jié)構(gòu)(跨越殘基15、16、27、28)，這些螺旋結(jié)構(gòu)能夠以40°角插入疏水－親水表面，因此能夠促進(jìn)細(xì)菌素分子插入到目標(biāo)菌株的細(xì)胞質(zhì)膜;Fimland 等［22］通過結(jié)合 pediocin PA－1，sakacin P and curvacin A(sakacin A)的N端部分(殘基1－21)和這些細(xì)菌素的C端部分構(gòu)建雜交的Ⅱa類細(xì)菌素，分別描述為 Ped－Sak，Sak－Ped，Cur－Sak和Sak－Cur，這些雜交的Ⅱa類細(xì)菌素都包含α螺旋區(qū)域，但只有Ped－Sak(結(jié)合 pediocin PA－1的1－21殘基和sakacin P末端的22殘基)具有傾斜的α螺旋結(jié)構(gòu)域，因此只有Ped－Sak能夠以45°角插入到目標(biāo)膜的疏水－親水表面，并且保持了和原始細(xì)菌素同樣的抗菌活性。

3.4 C端疏水區(qū)域形成的兩親性α螺旋與抗菌活性的關(guān)系

如圖1C③和④，Ⅱa類細(xì)菌素的疏水C端和兩親α螺旋參與了細(xì)菌素插入目標(biāo)膜受體分子的磷脂雙分子層和導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄露及溢出的過程［23－24］。與N端不同的是，C端區(qū)域包含假定的跨膜螺旋，這些跨膜螺旋使Ⅱa類細(xì)菌素的C端區(qū)域具有更多的多樣性，并且這些細(xì)菌素對目標(biāo)指示菌的專一性有一定作用。Fimland等［22］通過對雜交細(xì)菌素 Ped－Sak，Sak－Ped，Cur－Sak 和 Sak－Cur的結(jié)構(gòu)觀察表明C端是Ⅱa類細(xì)菌素抑制目標(biāo)指示菌的主要結(jié)構(gòu)域，并且是膜識別的重要結(jié)構(gòu)域。Fimland等［25］對pediocin－PA－1的研究結(jié)果證實(shí)了 pediocin－PA－1的C端(20－34個(gè)殘基)是插入目標(biāo)膜受體分子的決定結(jié)構(gòu)域，對膜識別區(qū)域有非常重要的作用，此外，pediocin－PA－1的C端影響 pediocin－PA－1的活性，可能是在目標(biāo)膜上的疏水區(qū)域被占據(jù)的結(jié)果。Jitka Rihakova等［14］利用單個(gè)氨基酸替換產(chǎn)生位點(diǎn)突變菌株，研究了C端區(qū)域?qū)ivercin V41抗菌活性的影響，研究結(jié)果表明刪除C端區(qū)域?qū)⒔档虳ivercin V41的抗菌活性。Hele'n Sophie Haugen等［26］的研究表明pediocin PA－1 C端螺旋區(qū)域片段顯示的抗菌活性是pediocin PA－1的一半。Todorov等也指出C端是細(xì)菌素區(qū)別目標(biāo)細(xì)胞特異性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域［27］。

4 二硫鍵與抗菌活性的關(guān)系

所有Ⅱa類細(xì)菌素都至少包含一個(gè)二硫鍵，二硫鍵對Ⅱa類細(xì)菌素的抗菌活性也可能有一定的影響。趙愛珍等［28］依據(jù)Enterocin A的氨基酸序列，設(shè)計(jì)半胱氨酸替換突變體Enterocin A(C14S)和Enterocin A(C47W)，通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得重組突變體。用還原劑β－巰基乙醇處理MBP－Enterocin A，采用瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測重組Enterocin A、突變體及還原產(chǎn)物的抗無害李斯特菌LIN3活性，結(jié)果表明:N末端融合部分不含有半胱氨酸的MBP－Enterocin A或His tag－Enterocin A均表現(xiàn)強(qiáng)抗菌活性;而N末端融合部分含有半胱氨酸的GST－Enterocin A，表現(xiàn)很弱的抗菌活性;半胱氨酸替換突變體及MBP－Enterocin A還原產(chǎn)物均不顯示抗菌活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明二硫鍵是Enterocin A抗菌活性的重要影響因素。Clarissa S.Sit等［29］為了探討 leucocin A的構(gòu)效關(guān)系，在建立leucocin A的3D結(jié)構(gòu)以后，利用化學(xué)合成的方法合成了一系列代替第9和第14位殘基的結(jié)構(gòu)類似物［26，28］，研究結(jié)果表明，二硫鍵用 C 環(huán)替代后將會(huì)導(dǎo)致 leucocin A 活性降低10倍。Clarissa S.Sit等［30］揭示了未激活(C9S，C14S)－leucocin A和激活(C9L，C14L)－leucocin A的3D溶液結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明利用Ser和Leu來替換兩個(gè)cys殘基，并沒有影響到抗菌肽的電荷，因此可以說明二硫鍵并沒有干涉到細(xì)菌素與目標(biāo)菌體細(xì)胞膜的靜電相互作用。

圖1 Ⅱa類細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)模型及對目標(biāo)細(xì)胞膜的假設(shè)作用位點(diǎn)［31］Fig.1 Schanatic representation of the structure of a modelⅡa bacteriocin and the predicted location its domains with respect to target cell membrane［31］

5 陽離子氨基酸與抗菌活性的關(guān)系

由于含有陽離子氨基酸的Ⅱa類細(xì)菌素不能有效地與細(xì)胞膜表面結(jié)合，從而使Ⅱa類細(xì)菌素抗菌活性減弱，研究者們相繼證實(shí)了這一觀點(diǎn)。Miller KW等［2］研究表明在 pediocin AcH中的陽離子氨基酸Lys－1，His－42 and Lys－43 使抗菌活性減少，主要原因是細(xì)菌素不能有效地與細(xì)胞膜表面結(jié)合。相反，Chen等［3］研究表明突變的 pediocin PA－1殘基由于缺少帶陽離子的Lys－11和 His－12，以至于不能與目標(biāo)細(xì)胞膜結(jié)合，從而使抗菌活性消失。此外，還有一種觀點(diǎn)認(rèn)為pediocin PA－1三個(gè)His殘基的質(zhì)子化對于目標(biāo)細(xì)胞膜的吸附作用最大，pediocin PA－1的Lys－11對于目標(biāo)細(xì)胞膜孔的形成非常重要。

6 其它氨基酸與抗菌活性的關(guān)系

Miller KW等［2］研究結(jié)果表明用色氨酸 Trp－18代替pediocin PA－1中的精氨酸Arg會(huì)導(dǎo)致兩個(gè)數(shù)量級的抗菌活性損失。對于大多數(shù)Ⅱa類細(xì)菌素來說，這個(gè)位置的Trp是很好的保留殘基。相似的，去除N端Trp殘基，mesentericin Y105的抗李斯特活性也戲劇性地降低。D J Derksen等［32］利用不相關(guān)的氨基酸代替leucocin A 9位和14位的胱氨酸，結(jié)果表明替換后的細(xì)菌素與leucocin A相比，活性并沒有改變，為了解釋這一現(xiàn)象D.J.Derksen提出了一種假說認(rèn)為側(cè)鏈之間的相互作用可能使第9位和第14位殘基之間形成一個(gè)環(huán)，從而維持細(xì)菌素活性的形成［29，33］。

7 結(jié)論

目前，Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的構(gòu)效關(guān)系還沒有研究透徹，主要停留在報(bào)道較多的細(xì)菌素上，如pediocin PA－1、Enterocin A 等，對近些年來新分離出的具有較強(qiáng)、廣譜抗菌活性的Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素構(gòu)效關(guān)系的研究較少。因此，未來的研究如果能擴(kuò)大研究范圍必定會(huì)取得突破性成果，也為未來Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。另外，利用Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系來研究和獲得具有抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜寬、穩(wěn)定性高的細(xì)菌素或類似物也是一個(gè)很好的研究方向。

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