普洱茶對酒精性脂肪肝大鼠抗氧化應激作用的研究

王 蕊，肖 蓉，劉家奇，楊蘭蘭，劉文文，施瀚超，侯 艷，*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，云南昆明650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學龍潤普洱茶學院，云南昆明650201;3.云南省昆明市動物疫病預防控制中心，云南昆明650000;4.云南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，云南昆明650201)

近年來，酒精已成為病毒性肝炎后導致肝損害 的第二大病因［1］?，F(xiàn)代研究證實，普洱茶具有降脂、減肥、降壓、抗動脈硬化;防癌、抗癌;養(yǎng)胃、護胃;健牙護齒;消炎、殺菌、治痢;抗衰老等作用［2－6］，普洱茶以其廣泛的生物學效應，尤其是抗氧化效應和降血脂、降血糖效應，對于酒精性脂肪肝的防治顯示出誘人的應用前景。細胞色素P450，是肝臟代謝最主要的酶系之一，其中細胞色素P4502E1(CYP2E1)與酒精代謝密切相關，CYP2E1是細胞色素P450的乙醇誘導形式，它可催化乙醇產(chǎn)生過氧化物，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，在酒精性肝損傷發(fā)病機制中起重要作用［7］，細胞色素P4502E1是主要在肝臟表達的細胞色素P450重要的亞型，國內(nèi)對酒精性肝損傷的研究主要集中在氧化損傷方面，而參與氧化代謝的重要代謝酶亞型CYP2E1在酒精引起的酒精性肝損傷中的變化及作用環(huán)節(jié)尚未明確。胰島素樣生長因子1(IGF－1)具有胰島素樣作用，對糖、脂代謝的作用與胰島素有類似之處，IGF－1能改善肝功能，減輕肝臟氧化損傷［8－9］，動物試驗提示低劑量 IGF－1 有抗肝纖維化作用［10］，在一定程度上 IGF－1水平可以反映肝臟細胞的活性。肝臟是合成IGF－1的主要場所，如果肝細胞受損則IGF－1表達降低，已有報道IGF－I在肝硬化患者中的含量明顯下降，但它與酒精性脂肪肝的關系鮮見報道，鑒于此，本試驗選取與預防肝細胞氧化損傷關系密切的CYP2E1、IGF－1為分子靶點，同時測定肝組織中的抗氧化指標、血清血脂指標及胰島素水平，探索普洱茶對酒精性肝組織損傷的分子機制及普洱茶對酒精性脂肪肝大鼠抗氧化應激作用的影響，為普洱茶作為防治肝臟疾病的藥物原料或保健食品的開發(fā)研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍潤普洱茶熟茶(2007年10月) 云南云縣天龍生態(tài)茶葉有限責任公司生產(chǎn)(產(chǎn)品標準號:DB53/103－2007);版納普洱熟茶(2007年7月) 云南省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，西雙版納普洱茶研究院(產(chǎn)品標準代號:DB53/103);帕卡普洱熟茶(2007年5月) 云南省思茅茶樹良種場，中國普洱茶研究院(產(chǎn)品標準代碼:DB53/103)，將上述茶樣按1∶1∶1等量混合制成受試茶樣;藥物組藥品 市售某保肝藥物;活性氧(ROS)、胰島素(INS)試劑盒 北京奇松生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－PX)、丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)、游離脂肪酸(FFA)試劑盒 南京建成生物工程研究所;SPF級Wistar雄性大鼠(180～220g) 由北京維通利華試驗動物技術有限公司提供(批號:SCXK(京)2012－0001);動物飼料 由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物飼料營養(yǎng)成分及能量組成如表1。

L－3280半自動生化分析儀 上?？迫A試驗系統(tǒng)有限公司生產(chǎn);7900HT熒光定量PCR儀 新加坡制造;Epppendorf－4910單道微量可調(diào)移液器 德國Epppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 茶湯制備方法 普洱茶(熟茶)磨碎后制備茶湯，制備方法參照文獻［5］。提取的茶湯終濃度為1g/mL，滅菌后置于4℃冰箱保存待用。

1.2.2 動物分組與處理 根據(jù)所評價的功能性試驗動物要求，選用外形符合健康標準，體重在180～220g之間的SPF級Wistar雄性大鼠為試驗對象。觀察喂養(yǎng)3d后，剔除不合格鼠，按體重隨機分為陰性對照組、陽性對照組、藥物組，普洱茶(熟茶)低、中、高劑量組，每組10只，共60只。陰性對照組每天飼喂陰性對照組液體飼料，其他各組大鼠均飼喂試驗組飼料，每天定時經(jīng)口灌胃受試樣品。普洱茶組給予不同劑量普洱熟茶(低、中、高劑量分別為人體推薦攝入量的5、10、20 倍，即 0.5、1.0、2.0g/kg·bw)，藥物組灌胃藥品(0.15g/kg·bw)［11］，一次經(jīng)口灌胃 2mL/d，陰性對照組和陽性對照組均灌胃等體積的蒸餾水。

表1 動物飼料營養(yǎng)成分及能量組成表Table 1 Nutritional composition and energr of feed

1.2.3 動物飼養(yǎng)管理 大鼠同室單籠飼養(yǎng)，采用液體飼料飼喂，每天晚上定時更換飼料并記錄大鼠攝食量，環(huán)境溫度控制在(20±2)℃，濕度45%～60%?；\具、墊料舒適、衛(wèi)生、無毒、安全，飼養(yǎng)房間定時用消毒劑消毒，房間定時通風，使其保持一個良好的飼養(yǎng)環(huán)境。

1.2.4 測定指標與方法 試驗第60d，大鼠12h禁食不禁水，股動脈采血，分離血清，測定血清中 TG、FFA、INS水平，犧牲大鼠后，摘取肝組織，制備10%的肝臟勻漿，測定肝組織中ROS、SOD、GSH－Px活性及MDA含量;檢測方法參照試劑盒說明書進行。

RNA提取和 RT－PCR:肝臟總 RNA的提取和cDNA的合成分別用 TRIZOL和TAKARA(Code:DRR047A)試劑盒按試劑盒標準步驟操作。PCR引物序列:R－CYP2E1:CAAGGCTGTCAAGGAGG TGCTACTG，GCTTAGGGAAAACCTCCGCACATCC;

R－IGF－1:AGCGCCACACTGACATGCCC，GGATCTTGCGGTGACGTGGC;

內(nèi)參照 Gapdh:GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGT，AACCAGGCGTCCGATACGGC。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法 采用SPSS17.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 普洱茶對酒精性脂肪肝大鼠體重的影響

表2顯示，與陰性對照組相比，陽性對照組大鼠體重和體重凈增值顯著下降(p＜0.01)，與陽性對照組相比，普洱茶高劑量組大鼠體重和體重凈增值顯著下降(p＜0.05，p＜0.01)。

表2 普洱茶對Wistar大鼠體重的影響Table 2 The influence of Pu－erh tea on the body weight in wistar rats

表3 普洱茶對大鼠肝組織GSH－PX、ROS|、SOD活性、MDA含量的影響Table 3 The influence of fermented Pu－erh tea on liver tissue levels of GSH－Px、SOD、ROS and MDA in wistar rats

表4 普洱茶對大鼠血清INS活性、FFA、TG含量的影響Table 4 The influence of Fermented Pu－erh tea on serum levels of INS、FFA、TG in wistar rats

2.2 普洱茶對酒精性脂肪肝大鼠肝組織GSH－PX、ROS、SOD活性、MDA含量的影響

表3顯示，與陰性對照組相比，陽性對照組大鼠肝組織GSH－PX活性顯著下降(p＜0.01);SOD活性有所下降，但差異不顯著(p＞0.05);ROS活性、MDA含量顯著升高(p＜0.05)。與陽性對照組相比，普洱茶高劑量組和藥物組大鼠肝組織GSH－PX活力、中、高劑量組大鼠肝組織SOD活性顯著升高(p＜0.05，p＜0.01);普洱茶中、高劑量組和藥物組大鼠肝組織ROS活性、高劑量組大鼠肝組織MDA含量顯著下降(p＜0.05，p＜0.01)。

2.3 普洱茶對大鼠血清INS活性、FFA、TG含量含量的影響

表4顯示，與陰性對照組相比，陽性對照組血清INS水平和FFA、TG含量顯著上升(p＜0.01)。與陽性對照組相比，普洱茶低、中、高劑量組及藥物組大鼠血清 INS活力、TG含量顯著下降(p＜0.05，p＜0.01);普洱茶中、高劑量組與藥物組大鼠血清FFA含量顯著下降(p＜0.01)。

2.4 普洱茶對酒精性脂肪肝大鼠肝組織CYP2E1、IGF－1基因表達的影響

表5顯示，與陰性對照組相比，陽性對照組大鼠肝組織CYP2E1基因表達量上升，但差異不顯著(p＞0.05)，IGF－1基因表達顯著下降(p＜0.05)。與陽性對照組相比，普洱茶高劑量組CYP2E1基因表達量顯著下降(p＜0.05)。IGF－1基因表達顯著上升(p＜0.05)。

表5 普洱茶對酒精性脂肪肝大鼠肝組織CYP2E1及IGF－1基因表達的影響Table 5 The influence of Fermented Pu－erh tea on Gene expression quantity of CYP2E1 and IGF－1 in rats with alcoholic fatty liver

3 討論

3.1 普洱茶對酒精性脂肪肝大鼠肝組織CYP2E1基因表達的影響

細胞色素P450，是一組相對非特異性酶，廣泛存在于機體內(nèi)，但主要存在于肝細胞微粒體上，是肝臟代謝最主要的酶系之一，是參與藥物代謝及身體其他外來物質(zhì)代謝作用重要的酶。其中細胞色素P4502E1(CYP2E1)與酒精代謝密切相關，CYP2E1是細胞色素P450的乙醇誘導形式，它在非乙醇脫氫酶氧化途徑中起重要作用，為酒精性肝病的主要發(fā)病機制［12］。CYP2E1在酒精性肝病的發(fā)病機制中主要參與脂質(zhì)過氧化反應，與ROS生成有關。酒精在肝細胞內(nèi)通過細胞色素CYP2E1并在鐵離子參與下的氧化作用，會產(chǎn)生過多的ROS，如·OH－、O2－·、H2O2等自由基，這些活性氧自由基可激活磷脂酶及脂質(zhì)過氧化反應，降低膜磷脂，改變其通透性和流動性，從而改變與膜結合的酶、受體和離子通道的微環(huán)境，影響其功能，還可以刺激肝星狀細胞分泌膠原，最終導致肝纖維化的產(chǎn)生［13］。此外，乙醇的攝入可誘導CYP2E1基因的表達，CYP2E1具有很強的氧化活性，能將乙醇氧化生成乙醛，產(chǎn)生大量活性氧中間產(chǎn)物并激活Kupffer細胞釋放炎癥因子，使ROS增多;隨著CYP2E1表達的增強，體內(nèi)清除ROS自由基的SOD、GSH－PX含量均顯著下降。由于脂質(zhì)過氧化反應的增強而抗氧化能力的下降，導致ROS的生成增多，進一步促進脂質(zhì)過氧化反應，使MDA生成增加，最終導致肝細胞結構與功能的損害。另外還發(fā)現(xiàn)，自由基可以在肝細胞膜上與CYP2E1結合引起抗體依賴的細胞毒作用，使肝細胞損傷，導致酒精性肝病的病理變化。

本試驗研究結果顯示:RT－PCR方法測定CYP2E1mRNA表達說明，與陰性對照組比較，陽性對照組大鼠肝組織中CYP2E1基因表達上升，ROS活性、MDA含量顯著升高，肝組織中SOD和GSH－PX活力顯著下降，提示攝入酒精后會誘導CYP2E1表達上升，進而導致ROS大量生成，從而加重酒精性脂肪肝大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化反應，由此可知，CYP2E1基因的高表達與脂質(zhì)過氧化是脂肪肝發(fā)病過程中不可忽略的重要因素。給予普洱茶和受試藥物后，各試驗組大鼠肝組織CYP2E1基因表達、ROS活性、MDA含量均下降，SOD和GSH－PX活力顯著升高，提示普洱茶可有效抑制酒精性脂肪肝大鼠肝組織CYP2E1基因表達，但其具體的作用機制還需進一步研究。

通過對抗氧化指標的檢測提示:普洱茶可能通過提高清除自由基的SOD和GSH－PX的活性，進一步提高機體抗氧化的能力，進而增強了脂質(zhì)代謝的能力，減緩了脂毒性，提高了機體防御和消除自由基的能力，降低機體脂質(zhì)過氧化的程度，從而預防和減輕了酒精性脂肪肝的發(fā)生或發(fā)展。這可能與普洱茶含有多種生物活性成分有關。普洱茶中含有的茶多酚和茶多糖，具有結合自由基，抑制細胞色素參與親電子代謝物的形成，阻斷或減慢氧化應激和炎癥反應，防止機體脂質(zhì)過氧化等作用［14］

3.2 普洱茶對酒精性脂肪肝大鼠肝組織IGF－1基因表達的影響

IGF－l是由70個氨基酸組成的單鏈多肽。主要由肝細胞分泌，它具有廣泛的生理作用，在細胞的生長、分化及代謝的調(diào)節(jié)有著重要的作用，IGF－1和胰島素有50%的序列相同，血液中的 IGF－l主要來源于肝臟的生物合成，在代謝方面IGF－1具有胰島素樣作用［15］，其中類似胰島素的代謝效應主要表現(xiàn)為:促進組織攝取葡萄糖，刺激糖原異生和糖酵解;促進糖原合成，促進蛋白質(zhì)和脂肪合成，抑制蛋白質(zhì)和脂肪分解，減少血液FFA和氨基酸的濃度。有研究表明IGF－1的表達能有效降低糖尿病動物的血糖［16］;IGF－1在肝組織［17］對胰島素抵抗有保護作用，能改善肝功能，減輕肝臟氧化損傷［8－9］。

本研究試圖探討IGF－l對酒精性脂肪肝的影響，從而為臨床治療酒精性脂肪肝提供依據(jù)，結果表明，酒精性脂肪肝大鼠肝組織IGF－l基因表達顯著下降，考慮機制如下:IGF－l主要在肝臟合成，其合成受生長激素(GH)的控制，稱為 GH－IGF－l軸，GH 與GH受體結合后在肝內(nèi)促進IGF－l的基因轉(zhuǎn)錄［18］。當肝臟嚴重受損時，肝細胞合成GH受體能力降低，肝細胞GH受體表達減少，從而使IGF－1表達減少。此外酒精性脂肪肝大鼠體內(nèi)血清FFA、TG、INS水平顯著上升，提示酒精性脂肪肝大鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，胰島素水平異常。有研究表明，血循環(huán)中FFA濃度過高以及非脂肪細胞(主要是肌細胞、肝細胞、胰島β細胞)內(nèi)脂質(zhì)含量過多，可通過各種有關途徑導致胰島素抵抗的發(fā)生，以及引起胰島β細胞性凋亡和分泌INS功能缺陷［19］，導致INS異常，本試驗結果也證明了這一點。胰島素抵抗在脂肪肝的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［20－21］。有研究表明，外周胰島素抵抗可能使抑制激素敏感性脂肪酶的活性下降，外周脂肪組織分解增加，F(xiàn)FA水平升高，而FFA水平升高可加劇患者的胰島素抵抗［22］，這樣INS、FFA之間形成了一個惡性循環(huán)，加重肝細胞損傷。給予普洱茶后，IGF－l基因表達顯著上升，各試驗組 INS水平和FFA、TG含量顯著下降，提示，普洱茶可有效促進IGF－1基因的表達，大量的IGF－1有促使肝細胞增殖，加強肝臟的合成和代謝功能，從而促進受損肝細胞恢復的作用。試驗結果也證實，隨著IGF－1基因表達量上升，各試驗組FFA、TG含量顯著下降，這可能與IGF－1能加強代謝功能、改善肝功能、減輕肝臟氧化損傷、有效改善胰島素抵抗有關。

4 結論

綜上所述，本批次普洱茶(熟茶)在本試驗條件下，可有效抑制酒精性脂肪肝大鼠體內(nèi)CYP2E1基因的表達，促進IGF－1基因表達，進而改善大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷、有效降低大鼠血脂水平，改善胰島素抵抗，進而起到了抗氧化應激的作用，有效的預防了酒精性脂肪肝的發(fā)生和發(fā)展。

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