凍藏方式對豬肉肌原纖維蛋白氧化及凝膠特性的影響

潘君慧，劉澤龍

(1.浙江省亞熱帶作物研究所，浙江溫州325005;2.中糧營養(yǎng)健康研究院，北京100020)

凍藏肉是目前肉類產(chǎn)品進出口貿易和地區(qū)間流通的主要產(chǎn)品形態(tài)，也是我國肉制品未來發(fā)展的方向之一。在凍藏過程中，肉制品的質構、風味、顏色會發(fā)生不可逆轉的劣變。近年的研究證據(jù)顯示，除了脂質的氧化，蛋白冷凍變性外，蛋白氧化也是導致凍藏肉品品質劣化的重要原因［1－2］。在肉及肉制品中，肌原纖維蛋白作為主要蛋白質，對肉蛋白功能尤其是凝膠性起主要作用。肌原纖維蛋白對活性氧的攻擊非常敏感，受氧化后其結構會發(fā)生顯著改變如形成蛋白聚集體等，而這些現(xiàn)象均會使蛋白質的凝膠性發(fā)生較大變化［3］。因此，尋找合適的措施控制凍藏過程的氧化，并且保持凍藏肉肉品品質和蛋白功能具有重要研究意義。本文從實際體系研究出發(fā)，主要討論了三種包裝處理的凍藏肉中肌原纖維蛋白的凝膠特性，以闡明儲藏方式對肌肉蛋白凝膠功能性質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗用肉 實驗選取新鮮豬后腿肉(購于當?shù)貥焚彸?，宰?d)，經(jīng)過剔除筋膜后通過三遍切片機切片切丁(10mm×10mm×10mm)，混勻后取部分肉(或提取肌原纖維蛋白)作為空白進行相關指標的測定，其余部分分裝后按三種方式包裝:1號處理為普通密封包裝、2號處理為混合添加抗壞血酸、α－生育酚和茶多酚(各0.2%，w/w)后進行普通密封包裝、3號處理為真空密封包裝，樣品被放入－18℃冰箱儲藏放置24周，并在第2、4、8及24周各取樣約20 g進行分析。

超純水 美國Millipore公司;2，4－二硝基苯肼(DNPH) 美國Sigma公司;其它試劑(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司。

UV－2800H型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;BVPJ－500TS真空包裝機 嘉興艾博不銹鋼機械工程有限公司;DS－1高速組織搗碎機 上海精科實業(yè)有限公司;Avanti J－26 XP高速冷凍離心機 美國Beckman公司;AR1000流變儀英國TA Instrument公司;T18 basic高速均質機 英國IKA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肌原纖維蛋白的提取 凍藏肉在4℃經(jīng)過6h解凍，用5倍提取緩沖液(0.1mol/L NaCl，2mmol/L MgCl2，1mmol/L EDTA，10mmol/L K2HPO4，pH7.0)勻漿后離心(2000g，10min)，重復四次并在第四次離心前用四層紗布過濾并將pH調至6.0，最后得到的蛋白膏保存于冰盒中備用。蛋白濃度用雙縮脲法測定。

1.2.2 羰基的測定 參考Levine等人測定羰基含量的方法，讀取樣品在370nm下的吸光值，蛋白質羰基衍生物的含量(nmol/mg蛋白)使用摩爾吸光系數(shù)為22000M－1cm－1計算［4］。

1.2.3 K－ATP酶活性的測定 參考Katoh等人［5］的方法，測定 K－ATPase酶活。酶活力表示為:μmol Pi/mg蛋白/10min。

1.2.4 蛋白凝膠流變學特性的測定 使用流變儀測定肌原纖維蛋白在程序升溫和降溫過程中凝膠形成所產(chǎn)生的力學變化。設定的主要參數(shù)是:采用4cm直徑的平板夾具，對混合蛋白進行溫度掃描，以2℃/min的速率從20℃升至75℃，每個溫度點的平衡時間為30s，最大應變力為0.02，單頻頻率為0.1Hz，狹縫為1mm。在平板夾具上蓋好保護蓋并滴加硅油密封后進行測定。

1.2.5 蛋白凝膠的制備 將5g濃度為30mg/mL肌原纖維蛋白溶液置于瓶底玻璃管中(50mm×20mm)離心(800g，1min，4℃)除去氣泡，然后置于恒溫水浴鍋中，從20℃開始以1.2℃/min的速率升溫，至75℃時取出迅速置于冰浴中冷卻。

1.2.6 蛋白凝膠持水性 凝膠(約5g，記為W1)在4℃靜置過夜后，移至50mL的離心管中并記重(W2)，離心(10000g，15min，4℃)。倒掉離心出的水，將離心管倒置于鋪有吸水紙巾的桌面上，15min后稱重(W3)。蛋白凝膠持水性計算如下:

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 本實驗所有數(shù)據(jù)均為2次重復3次平行。數(shù)據(jù)處理使用Statistix 9.0軟件進行方差分析和顯著性分析(LSD法)，不同顯著性數(shù)據(jù)用不同字母標記。

2 結果與討論

2.1 凍藏肉儲藏過程中蛋白羰基與酶活變化

由圖1中可見，普通密封包裝樣品的蛋白羰基含量均高于其他兩種處理方式;在儲藏8周內，復合抗氧化劑的添加使得蛋白羰基維持在比較低的水平(p＞0.05)，隨著儲藏時間的延長，由于抗氧化劑的消耗，蛋白羰基有所增加。另外，也還可能由于儲藏過程中抗壞血酸轉變?yōu)槊摎淇箟难崤c肌肉中的微量過氧化氫和鐵離子形成金屬催化氧化體系，加劇了蛋白在儲藏后期的氧化［3，6］。而氧氣的去除(3號)可以有效抑制儲藏期間蛋白羰基的生成(p＞0.05)。

圖1 凍藏及不同包裝處理對肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig.1 Effect of frozen storage on protein carbonyl content of myofibrillar protein in muscle by different packaging treatments

從圖2中可以看出，由于肌球蛋白頭部酶活性對氧化很敏感，1號和3號樣品的肌球蛋白的ATP酶活和文獻報道相一致:總體都呈現(xiàn)出下降的趨勢，表明肌球蛋白頭部構象的變化［7－8］。除氧化影響外，酶活的損失可能更多的與在冷凍和解凍過程中內源蛋白酶類對肌球蛋白頭部水解有關［9］。在2號處理中，為抑制氧化而添加的復合抗氧化劑并未起到穩(wěn)定肌球蛋白構象的作用，反而在儲藏前期，直接或者間接影響了肌球蛋白頭部活性區(qū)域的氨基酸殘基，抑制了肌球蛋白的ATP酶活。

圖2 不同包裝處理凍藏后對肌球蛋白K－ATP酶活性的影響Fig.2 Effect of different packaging treatments on myosin K－ATPase activity during 24－week frozen storage

2.2 凍藏后的肌原纖維蛋白凝膠流變特性

三種處理肉肌原纖維蛋白的流變學特征(彈性模量，G')見圖3?？瞻讟悠返牧髯兦€顯示，在45～50℃有一次凝膠轉變，隨后在50～57℃有一個肩峰為第二次凝膠轉變。第一次凝膠轉變過程中，主要由于肌球蛋白重酶解肌球蛋白變性［10］，蛋白間的相互作用增強，蛋白開始聚集，凝膠網(wǎng)絡開始形成。G'在47～50℃的下降，主要原因在于肌球蛋白的輕酶解肌球蛋白部分發(fā)生變性，并導致了肌球蛋白絲流動性的上升。隨著溫度繼續(xù)增加，肌球蛋白凝膠加速形成，肌動蛋白變性增強凝膠強度使得彈性模量持續(xù)上升。

圖3 三種處理樣品凍藏后肌原纖維蛋白凝膠的彈性模量變化Fig.3 Changes in storage modulus of myofibrillar protein gel made from three treatment samples during frozen storage

從圖3可以看出，經(jīng)過凍藏以后，三種樣品第一個凝膠轉變溫度的蛋白變性峰均有不同程度減弱，證實了在冷凍過程中肌球蛋白頭部均發(fā)生了部分變性。根據(jù)終貯能模量(終G')所示，樣品的凝膠能力均呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢，以1號和2號樣品更為明顯。此外，通過圖3a與3c的比較，可以發(fā)現(xiàn)凍藏時間對3號樣品肌原纖維蛋白凝膠的流變特性影響不大，這也與圖1中蛋白羰基變幅不大相對應;而圖3a中不同時間的儲藏對蛋白凝膠的形成有明顯影響，由于1號樣品中未除去氧氣，可以斷定氧化是重要的影響因素。另外，肌球蛋白頭部的氧化并未影響凝膠最終強度，結合文獻報道推斷凍藏過程中的肌球蛋白尾部的氧化影響了凝膠的終點彈性模量［10］。

2.3 凍藏后肌原纖維蛋白凝膠持水性

由圖4可見，在2～4周后，1號、2號樣品凝膠持水力相比空白樣品有顯著降低。已知蛋白凝膠通過毛細作用和蛋白水合作用束縛水分。雖然以上樣品由于蛋白氧化增強了肌原纖維蛋白的凝膠能力，但較高程度的氧化可能會破壞精細網(wǎng)絡結構的形成，反而降低了凝膠網(wǎng)絡束縛水分的能力［10］。在三種樣品中，2號樣品的凝膠持水性降低尤為顯著，這可能由于2.1中提到的脫氫抗壞血酸參與下的金屬催化氧化體系，以及形成了四價鐵血紅蛋白自由基而加速了蛋白肌原纖維蛋白氧化［3］。真空包裝樣品(3號)在儲藏期內的凝膠持水力變化幅度較小，且到24周還略有升高。這可能由于此時蛋白殘基的氧化修飾改變了蛋白表面電荷以及氫鍵，反而使肌原纖維蛋白的水合能力略有增加［11］。

圖4 凍藏后不同包裝處理肉的肌原纖維蛋白凝膠持水性Fig.4 Water holding capacity of myofibrillar protein gel from different treatment samples during frozen storage

3 結論

采用普通密封包裝以及添加復合抗氧化劑的的樣品隨著凍藏過程中氧化程度由輕到重，肌原纖維蛋白的凝膠能力均呈現(xiàn)出先增強后減弱的趨勢，但增強的凝膠能力并未改善凝膠的持水能力。其中，所用復合抗氧化劑在半年儲藏期內抑制冷凍肉蛋白氧化以及保持肌原纖維蛋白功能方面尚未達到理想效果。真空包裝盡管在防止蛋白氧化，保持肌原纖維凝膠能力及持水性方面有較好效果，但已知該包裝技術會增加肉品的汁液損失［12］。因此，還需要進一步研究抗氧化劑的復配，并尋找合適的措施綜合控制冷凍肉蛋白氧化及保持蛋白功能。

［1］Leygonie C，Britz T J，Hoffman L C.Impact of freezing and thawing on the quality of meat:Review［J］.Meat Science，2012，91:93－98.

［2］Lund M N，Heinonen M，Baron C P，et al.Protein oxidation in muscle foods:A review［J］.Molecular Nutrition ＆ Food Research，2011，55:83－95.

［3］Xiong Y L，Park D，Ooizumi T.Variation in the Cross－Linking Pattern of Porcine Myofibrillar Protein Exposed to Three Oxidative Environments［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，57:153－159.

［4］Levine R L，Williams J A，Stadtman E R，et al.Carbonyl assays for determination of oxidatively modified proteins［J］.Methods in Enzymology，1994，233:346－357.

［5］Katoh N，Uchiyama H，Tsukamoto S，et al.A biochemical study on fish myofibrillar ATPase［J］.Nippon Suisan Gakkaishi，1977 43:857－867.

［6］Utrera M，Estévez M.Oxidation of myofibrillar proteins and impaired functionality:Underlying mechanisms of the carbonylation pathway［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60:8002－8011.

［7］Ooizumi T，Xiong Y L.Biochemical susceptibility of myosin in chicken myofibrils subjected to hydroxyl radical oxidizing systems［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52:4303 －4307.

［8］Wagner J R，A?ó■ M C.Effect of frozen storage on protein denaturation in bovine muscle［J］.International Journal of Food Science ＆ Technology，1986，21:547－558.

［9］Benjakul S，Visessanguan W，Tueksuban J.Changes in physico－chemical properties and gel－forming ability of lizardfish(Saurida tumbil)during post－ mortem storage in ice［J］.Food Chemistry，2003，80:535－544.

［10］Xiong Y L，Blanchard S P，Ooizumi T，et al.Hydroxyl radical and ferryl－generating systems promote gel network formation of myofibrillar protein［J］.Journal of Food Science，2010，75:C215 －C221.

［11］Cheng Q，Sun D W.Factors affecting the water holding capacity of red meat products:A review of recent research advances［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2008，48:137－159.

［12］Payne S R，Durham C J，Scott S M，et al.The effects of non－vacuum packaging systems on drip loss from chilled beef［J］.Meat Science，1998，49:277－287.