基于RhaD醛縮酶的“一鍋四酶法”合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖

高雅慧，金則成，錢 超，李子杰，* ，中西秀樹，高曉冬

(1.江南大學食品學院，江蘇無錫214122;2.江南大學生物工程學院糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122)

稀有糖是近年來國際上研究功能性甜味劑的一個熱點，其定義為在自然界中存在但含量很低的單糖及其衍生物［1］。由于稀有糖在食用后產(chǎn)生能量較少且具有獨特的功能和潛在的醫(yī)療價值，受到廣泛關注［2－5］。在有機合成領域，醛縮酶催化的羥醛縮合反應已成為C－C鍵不對稱合成必不可少的工具之一［6－8］。 磷 酸 二 羥 基 丙 酮 (dihydroxyacetone phosphate，DHAP)依賴型醛縮酶催化生成的產(chǎn)物具有兩個新的立體中心［9］，其構型一般由醛縮酶決定，而不依賴于底物的結構或立體化學［10］。雖然利用該組酶類成功合成了許多常規(guī)化學法難以合成的糖類化合物［8－11］，然而專門用來合成稀有糖的研究還比較少。DHAP依賴型醛縮酶可接受多種醛作為受體，但對供體DHAP專一性很高［12］。由于DHAP價格昂貴且不穩(wěn)定，限制了該酶類實際合成應用［12－14］。為避免使用昂貴且不穩(wěn)定的底物DHAP，F(xiàn)essner等首次建立了“一鍋四酶法”［15］。作者前期結果表明 L－1－磷酸鼠李樹膠糖醛縮酶(L－rhamnulose 1－phosphate aldolase，RhaD)可以接受D－甘油醛作為受體，但失去了對D－甘油醛的立體選擇性，同時生成了兩種稀有糖 D－山梨糖和 D－阿洛酮糖［16］(圖1)。

圖1 利用RhaD酶法合成D－山梨糖和D－阿洛酮糖Fig.1 Enzymatic synthesis of D－sorbose and D－psicose with RhaD

在本研究中，為了降低反應成本，以更為便宜的底物DL－3－磷酸甘油代替L－3－磷酸甘油作為前體，采用“一鍋四酶法”的方法對D－山梨糖和D－阿洛酮糖的合成進行了優(yōu)化(圖2)。在羥醛縮合反應中，酸性磷酸酶(acid phosphatase，AP)常用來脫掉縮合產(chǎn)物的磷酸基團得到目的產(chǎn)物，此外磷酸酶YqaB在中性pH下對多種磷酸糖具有較強的磷酸酶活性［17］。探索在“一鍋四酶法”中用YqaB取代AP，可以減少酸堿及含鹽廢液的排放，代表了綠色食品的方向。

圖2 利用RhaD合成D－山梨糖和D－阿洛酮糖Fig.2 Synthesis of D－sorbose and D－psicose based on RhaD

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 由實驗室構建并保藏的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a－ rhaD，E.coliBL21(DE3)/pET28a－yqaB 用來表達 RhaD 醛縮酶［16］和YqaB 磷酸酶［18］;DL－3－磷酸甘油、D－甘油醛、磷酸甘油氧化酶(glycerol phosphate oxidase，GPO)、過氧化氫酶、酸性磷酸酶、D－山梨糖(D－sorbose)、D－阿洛酮糖(D－psicose)、茴香醛、Ca2+離子交換樹脂Sigma－Aldrich;薄層色譜 (ThinLayer Chromatography，TLC)、硅膠鋁板 60 F254、硅膠 60(200～400目) EMD Chemicals;Bio gel P－2膠、Aminex HPX－87H column(300mm ×7.8mm)Bio－Rad Laboratories;Pierce BCA蛋白濃度測定試劑盒及其他化學試劑 Thermo Scientific。

高效液相色譜儀 配有示差檢測器，日本島津公司;AKTAFPLC蛋白純化系統(tǒng) 美國GE Healthcare公司;IS－971R型全溫振蕩培養(yǎng)箱 韓國Lab Companion公司;Eppendorf－5415D離心機 德國Eppendorf公司;J2－21型離心機 美國Beckman公司;Buchi旋轉蒸發(fā)儀、恒溫水浴鍋 美國Fisher Scientific公司;真空冷凍干燥機 美國Labconco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 RhaD醛縮酶和YqaB磷酸酶的表達和純化參照前期的工作［16，18］的方法。

1.2.2 D－阿洛酮糖和D－山梨糖的合成 以DL－3－磷酸甘油為前體“一鍋四酶法”合成D－阿洛酮糖和D－山梨糖。

反應體系(10mL):DL－3－磷酸甘油(548.78mg，2.4mmol)，D－甘油醛(0.5mol/L 2mL，1mmol)，GPO(70U，2mg)，過氧化氫酶(1000U，1.18μL)，RhaD(272μL，終濃度0.5mg/mL)，補加無菌水使反應總體積為10mL。反應液在室溫下輕搖反應16～22h，反應通過TLC來檢測(展開劑為正丁醇∶乙酸∶水 =2∶1∶1(v∶v∶v))。反應終了后，向反應液中加入6mol/L HCl調pH為4.6，然后加入2μL AP(3U)，在37℃輕搖反應20～24h，用TLC來監(jiān)測反應(展開劑為正丁醇∶乙酸∶水 =2∶1∶1(v∶v∶v)或乙酸乙酯∶異丙醇∶水 =9∶3∶1(v∶v∶v))。反應完全后，用1mol/L NaOH 將 pH 調整到7.0。為了避免使用酸和堿，當以YqaB代替AP脫磷酸基團時，無需調pH直接向反應液中加入YqaB(終濃度為0.25mg/mL)和MgCl2(終濃度為2.5mmol/L)，反應液在37℃，150r/min反應約12h。

1.2.3 D－山梨糖和D－阿洛酮糖的分離純化參照文獻［16］。

1.2.3.1 硅膠純化 樣品的前處理:向反應液中加入適量甲醇并離心除掉變性蛋白，將上清液轉入到100mL的圓底燒瓶，在旋轉蒸發(fā)儀上30℃下減壓濃縮樣品。當樣品濃縮至5mL體積時，加入適量的硅膠，使上清液全部吸附到硅膠粉上并成粉末狀后，結束旋蒸。裝硅膠柱:將一根1.5cm×25cm玻璃柱子垂直固定于鐵架臺上。將1g硅膠粉加入約100mL的乙酸乙酯中，混勻后，一次性倒入柱子中，加壓，使乙酸乙酯液面距離硅膠面約4cm。上樣、純化及濃縮:將吸附有樣品的硅膠粉末小心地加入到硅膠柱，先用乙酸乙酯為流動相，去除一些非極性小分子，然后用流動相乙酸乙酯∶異丙醇∶水=9∶3∶1(體積比)進行洗脫并依次收集于試管中。按照先后順序用毛細管吸取洗脫液，依次滴到硅膠鋁板上，吹干，顯色，先初步判定哪些試管中的洗脫液含有目的產(chǎn)物。然后再以D－山梨糖，D－阿洛酮糖為標準物，以乙酸乙酯∶異丙醇∶水=9∶3∶1(體積比)為展開劑，重新做TLC以進一步確定哪些洗脫液中含有目的產(chǎn)物。將含有目的產(chǎn)物的洗脫液合并，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至1～2mL。

1.2.3.2 P－2凝膠排阻層析純化 P－2填料的前處理與裝柱:將一根1.5cm×90cm玻璃柱子垂直固定于鐵架臺上，加入脫氣后的去離子水至高度約20cm關閉出水口。按照P－2凝膠的說明對填料進行預處理后，輕輕地混勻，先倒入適量的填料到柱子，使其沉積一定的高度后，打開出水口，并不斷地加入填料，當膠面至合適高度時，用脫氣后的去離子水平衡柱子過夜。上樣與分離:關閉入水口，打開出水口，當液面降至膠面處時關閉出水口。將濃縮液(不超過2mL)小心均勻地加入到膠面上，當濃縮液完全進入到膠面內時，向柱床上方加入10mL去離子水并連通入水口，開始分離，并用自動收集器進行收集。用毛細管按順序依次點樣，吹干，顯色，初步確定哪些試管中的收集液含有目的產(chǎn)物，然后以標準品為對照，重新做TLC和HPLC進行確定。將含有目的產(chǎn)物的洗脫液合并，用真空冷凍干燥機凍干，稱重。

1.2.3.3 Ca2+離子交換樹脂純化 離子交換樹脂的前處理:樹脂用超純水浸泡30min后，傾倒以除去一些懸浮物，重復兩次。最后樹脂用超純水浸泡，輕輕混勻。裝柱及分離:將帶有夾套的玻璃柱子(26mm×100mm)垂直固定在鐵架臺上，關閉出水口，向柱子加入高度約20cm的超純水，倒入混勻的樹脂，待樹脂沉積到高度約10cm，打開出水口并不斷的加入樹脂，待樹脂高度距柱子的最上端約5cm時，裝柱完成，打開超純水的入水口，平衡柱子2h。將水浴鍋加熱，使水溫為70℃，通過蠕動泵將水輸入到夾套里，夾套的出水口通過管路重新流到水浴鍋里，平衡30min后，準備上樣。將凍干后的樣品D－阿洛酮糖和D－山梨糖的混合物用5mL的去離子水溶解，均勻地加到膠面上，待樣品液全部進入到柱床后，向膠面加入20mL去離子水后，打開入水口，開始分離純化，流速約1.5mL/min，使用自動收集器進行收集。用毛細管按順序依次點樣，吹干，顯色，初步確定哪些試管中的收集液含有目的產(chǎn)物，然后以標準品為對照，用TLC和HPLC進行確定，將含有D－山梨糖和D－阿洛酮糖的洗脫液分別合并，用真空冷凍干燥機凍干，稱重，1H NMR鑒定。

1.2.4 TLC顯色劑配制方法 18mL茴香醛溶于540mL 95%乙醇中，混勻置于冰水混合物上。將30mL 97%的硫酸與6mL乙酸混合得到混合酸，然后小心地將混和酸液逐滴加入到預冷的茴香醛乙醇溶液中并劇烈振蕩，將得到的無色溶液－20℃保存。

1.2.5 HPLC流動相的配制及反應液中D－山梨糖和D－阿洛酮糖比例的測定 272μL H2SO4加到含有1L去離子水(18.2MΩ·cm)的2L燒杯中，混勻。將裝配好的抽濾瓶連接到真空水泵，將流動相過濾脫氣，得到濃度為5mmol/L的流動相。利用色譜柱HPX－87H(300mm×7.8mm，氫型陽離子交換樹脂，填料為聚苯乙烯二乙烯苯樹脂)來測定終反應液中D－山梨糖和D－阿洛酮糖的比例。吸取反應液100μL離心，上清液用HPLC進行檢測。HPLC工作條件:5mmol/L H2SO4作為流動相，流速0.5mL/min，柱溫箱溫度60℃，示差檢測器進行檢測。采用相同的HPLC工作條件進行D－山梨糖和D－阿洛酮糖標準曲線的繪制。

2 結果與討論

2.1 TLC檢測以DL－3－磷酸甘油為前體的“一鍋四酶法”反應

當反應體系未加AP，以DL－3－磷酸甘油為底物，產(chǎn)物1－磷酸酮糖的生成的TLC分析如圖3－a所示，經(jīng)過正丁醇∶乙酸∶水 =2∶1∶1(v/v/v)展開劑展層、茴香醛染液染色，能夠檢測到1－磷酸酮糖的生成并在TLC板上顯示深靛藍色;向反應體系中加入AP進行脫磷酸化反應后產(chǎn)物D－山梨糖和D－阿洛酮糖的生成如圖3－b和圖3－c所示。當用正丁醇∶乙酸∶水=2∶1∶1(v/v/v)展開劑展層以及茴香醛染液染色后，同未加入AP相比，反應液加入AP后，在D－山梨糖和D－阿洛酮糖的位置有新點生成，但D－山梨糖和D－阿洛酮糖的Rf值很接近，在該展層劑下很難將兩者分開(圖3－b);為了較好地將D－山梨糖和D－阿洛酮糖分離開來，使用展開劑乙酸乙酯∶異丙醇∶水=9∶3∶1(v/v/v)進行展層，經(jīng)過茴香醛染液染色可以看到該展層劑可以很好地將D－山梨糖和D－阿洛酮糖分離開來并且反應液在D－山梨糖和D－阿洛酮糖的位置上有新點生成(圖3－c)。

圖3 TLC分析D－山梨糖和D－阿洛酮糖Fig.3 TLC analysis of D－sorbose and D－psicose

2.2 D－山梨糖和D－阿洛酮糖的HPLC檢測及比例測定

為了進一步確定得到的產(chǎn)物為D－山梨糖和D－阿洛酮糖，反應液用HPLC進行檢測，并用D－山梨糖和D－阿洛酮糖標準品作為對照。通過HPLC可以看出反應液在標準品D－山梨糖和D－阿洛酮糖的出峰位置都可以檢測到相應的產(chǎn)物(圖4)。為了計算這兩種稀有糖的比例，配制不同濃度的D－山梨糖和D－阿洛酮糖標準品溶液，采用相同的HPLC檢測條件，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，測得D－山梨糖/D阿洛酮糖比例約為1.2∶1。

2.3 D－山梨糖和D－阿洛酮糖的分離純化

圖4 HPLC分析D－山梨糖和D－阿洛酮糖Fig.4 HPLC analysis of D－sorbose and D－psicose

將上述反應液經(jīng)硅膠和P－2凝膠過濾純化，兩種單糖總的產(chǎn)率為39%(由于DL－3－磷酸甘油中所含有的L－3－磷酸甘油(1.2mmol)相對于D－甘油醛(1.0mmol)是過量的，轉化率按照D－甘油醛的量來計算)。D－山梨糖和D－阿洛酮糖混合物可以通過Ca2+離子交換樹脂進行分離，典型的分離曲線如圖5所示［16］。經(jīng)過Ca2+離子交換樹脂進行進一步分離，分別得到純的D－山梨糖和D－阿洛酮糖。

圖5 D－山梨糖和D－阿洛酮糖的分離曲線Fig.5 Separation profile of D－sorbose and D－psicose with cation exchange resin

2.4 YqaB磷酸酶取代AP用于D－山梨糖和D－阿洛酮糖的合成

為了驗證YqaB磷酸酶在“一鍋四酶法”合成中的應用，反應液用HPLC進行檢測，并以D－山梨糖和D－阿洛酮糖標準品作為對照。通過HPLC可以看出反應液在標準品D－山梨糖和D－阿洛酮糖的出峰位置都可以檢測到相應的產(chǎn)物(圖6)，從而表明YqaB可以實現(xiàn)脫磷酸化得到D－山梨糖和D－阿洛酮糖，并通過相同的方法測得D－山梨糖/D－阿洛酮糖的比例約為2∶3。通過硅膠純化、P－2凝膠過濾層析，得到D－山梨糖和D－阿洛酮糖這兩種單糖的混合物。由于在反應體系中，DL－3－磷酸甘油中L－3－磷酸甘油的量相對于D－甘油醛是過量的，根據(jù)D－甘油醛的量計算得到這兩種單糖總的產(chǎn)率為36%。D－山梨糖和D－阿洛酮糖的混合物經(jīng)過Ca2+離子交換樹脂純化，分別得到純的D－山梨糖和D－阿洛酮糖。

2.5 純化后的D－山梨糖和D－阿洛酮糖的1H NMR鑒定

為了鑒定經(jīng)過Ca2+交換樹脂分離得到的產(chǎn)物分別為D－山梨糖和D－阿洛酮糖，以D－山梨糖和D－阿洛酮糖的標準品作為對照，對產(chǎn)物進行1H NMR測定。由NMR比對結果可知，經(jīng)過分離純化后得到的產(chǎn)物為D－山梨糖和D－阿洛酮糖(圖7)。

圖6 HPLC分析D－山梨糖和D－阿洛酮糖Fig.6 HPLC analysis of D－sorbose and D－psicose

圖7 純化后的產(chǎn)物D－山梨糖和D－阿洛酮糖的1H NMR鑒定Fig.7 Characterization of the products D－sorbose and D－psicose after purification by1H NMR

3 結論

本研究在前期工作的基礎上，為避免在羥醛縮合反應中直接使用昂貴且不穩(wěn)定的底物DHAP，以便宜的底物DL－3－磷酸甘油作為前體物質，采用“一鍋四酶法”的方法對D－山梨糖和D－阿洛酮糖的合成進行了優(yōu)化，從而降低了反應成本。屬于鹵酸脫鹵酶超家族的非專一性磷酸酶YqaB在中性pH下對多種磷酸糖具有較強的磷酸酶活性。為了避免在稀有糖的合成中使用酸和堿，以YqaB取代AP進行了D－山梨糖和D－阿洛酮糖的合成。本研究所采用的方法適用于其他DHAP依賴型醛縮酶，相信該方法的建立將為稀有糖及其衍生物的大量合成提供理論依據(jù)。

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