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    黑牛肝菌多糖對小鼠酒精性腎損傷保護(hù)作用的研究

    2013-05-15 01:10:54趙云霞陶眀煊程光宇郭永月
    食品工業(yè)科技 2013年20期
    關(guān)鍵詞:牛肝菌酒精性自由基

    趙云霞,陶眀煊,*,程光宇,郭永月,邢 佳,彭 婕

    (1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院,江蘇南京210097;2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南京210046)

    過量飲酒是當(dāng)今世界范圍內(nèi)一個重要的公共衛(wèi)生問題,長期大量飲酒會導(dǎo)致許多臟器系統(tǒng)的損害[1]。肝臟是酒精代謝的主要器官,也是最容易受損的器官。腎臟是僅次于肝臟的乙醇排泄器官。機(jī)體攝入酒精后約10%在腎臟代謝,這些水溶性外源物質(zhì)在腎臟細(xì)胞和間質(zhì)內(nèi)積聚、濃縮,對腎臟可能造成一定程度的損害[2]。目前,國內(nèi)外有關(guān)酒精性肝損害的研究已較為深入,但對酒精性腎損害研究報道較少[3-6]。有研究表明,乙醇可導(dǎo)致以腎小管-間質(zhì)損害為主的病理改變,進(jìn)而可進(jìn)展至腎間質(zhì)纖維化、慢性腎功能衰竭[7-10]。

    黑牛肝菌(Boletus aereus,BA)是云南省資源較豐富的一種野生食用菌,其味道鮮美,具有很高的食用和藥用價值。研究表明[11-13],黑牛肝菌富含蛋白質(zhì)、維生素、多糖、氨基酸和各種礦物質(zhì)元素,對高血壓,高膽固醇和高血脂等疾病均有較好的功效。本研究以黑牛肝菌為原材料,探討了黑牛肝菌多糖對酒精所致小鼠腎損傷的保護(hù)作用,旨在為保健食品或天然藥物的研制和開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    黑牛肝菌子實體干品 購自云南麗江市古城區(qū)喜瑪拉雅貿(mào)易有限責(zé)任公司,經(jīng)去雜質(zhì),剪去含培養(yǎng)基的根部,于60℃低溫烘干后粉碎,過60目篩。將細(xì)粉經(jīng)熱水提取、濃縮、乙醇沉淀(1∶4,m/v)、低溫干燥等步驟后,得到粗多糖,粗多糖經(jīng)Sevage法脫蛋白、透析、乙醇沉淀、低溫干燥后得黑牛肝菌精多糖,經(jīng)測定多糖含量約為75.02%,蛋白含量為2.11%;ICR雄性小鼠 6周齡左右,體重(25.75±1.65)g,動物實驗在江蘇省中醫(yī)院動物飼養(yǎng)中心進(jìn)行,動物飼養(yǎng)許可證號(SYXK(蘇)2012-0047);四乙氧基丙烷 Fluka公司;谷胱甘肽(GSH)、牛血清白蛋白(BSA) Sigma公司;NBT、DTNB 南京卓爾生化有限公司;硫代巴比妥酸(TBA)、過氧化氫等生化試劑 為國產(chǎn)分析純。

    GL-22M型高速冷凍離心機(jī) 湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司;722型可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 造模 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d,每組10只,隨機(jī)分為模型組、藥物組(聯(lián)苯雙酯組,150mg/kg bw)、RPBA各劑量組(100、200、400mg/kg bw),另取10只健康小鼠為空白對照組。受試樣品用蒸餾水配制,每天灌胃一次,連續(xù)灌胃30d,實驗期間供給全價顆粒飼料,不限制飲食飲水,空白對照組和模型組每天灌等體積的生理鹽水。實驗至第31d,各組動物禁食不禁水12h后,模型組、藥物組及RPBA各劑量組以12mL/kg的量,灌以50%的乙醇溶液,建立動物急性肝損傷模型,空白組灌予等體積的生理鹽水。各組小鼠均在灌胃12h后取腎臟測定各項抗氧化指標(biāo)。

    1.2.2 腎勻漿的制備 準(zhǔn)確稱取0.1g腎臟,用生理鹽水洗去污血后拭干,剪碎并加入0.9mL預(yù)冷的50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.8),于冰水浴中進(jìn)行超聲破碎(400W,20s×3)制成10%腎勻漿。腎勻漿于4℃條件下10000r/min離心10min,一部分上清液用于測定MDA、GSH含量,另一部分上清液以3∶1的比例加飽和硫酸銨溶液,同樣條件下離心上清液即為粗酶液,用于測定SOD、CAT、GSH-Px活性。

    1.2.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定 測定方法在Stewert和Bewly[14]NBT光還原法的基礎(chǔ)上,略有改進(jìn)。取1mL的緩沖液(空白組)、組織粗酶液(樣品組)加入4mL NBT反應(yīng)液中,照光3~5min,以加入緩沖液的避光的反應(yīng)液作為空白對照,在722分光光度計上,于560nm波長測定各組的吸光度值。

    1.2.4 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的測定 測定方法在Yao Ping等[15]DTNB法的基礎(chǔ)上,略有改進(jìn)。測定時取0.4mL 1.0mmol/L GSH+0.4mL 10%組織勻漿液作為樣品管,取0.4mL 1.0mmol/L GSH+0.4mL雙蒸水作為非酶管,37℃水浴預(yù)溫5min,分別加入0.2mL預(yù)熱的H2O2,3min后加4mL偏磷酸沉淀液,3000r/min離心10min,分別取上清液2mL+2.5mL 0.32mol/L Na2HPO4+0.5mL DTNB顯色液;另取0.4mL雙蒸水+1.6mL+2.5mL 0.32mol/L Na2HPO4+0.5mL DTNB顯色液作空白管?;靹颍覝胤胖?0min后,以蒸餾水為空白對照,于420nm處測定吸光度。

    1.2.5 過氧化氫酶(CAT)活性的測定 CAT活性的測定采用改進(jìn)的紫外分光光度法[16]。

    1.2.6 還原性谷胱甘肽(GSH)含量的測定 GSH含量按文獻(xiàn)[17]測定,略有改進(jìn)。取10%肝勻漿0.5mL加4%磺基水楊酸0.5mL混勻,室溫下3500r/min離心10min。取0.5mL上清液+4.5mL DTNB做測定管;另取0.5mL 4%磺基水楊酸+4.5mL DTNB做空白管?;靹?,室溫放置10min后,以空白管為空白對照,于420nm處測定吸光度。

    1.2.7 過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量的測定 MDA含量的測定采用改進(jìn)的硫代巴比妥酸(TBA)法[18]。

    1.2.8 數(shù)據(jù)分析 實驗數(shù)據(jù)用DPS 13.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,單因素方差分析檢驗組間顯著性差異,數(shù)據(jù)用x±s表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 RPBA對小鼠體重增長的影響及對酒精損傷小鼠一般情況的觀察

    由表1可知,造模前后各組小鼠體重沒有顯著性差異,說明酒精對其生長沒有顯著地影響。觀察期造模后的表現(xiàn),發(fā)現(xiàn)給予50%的乙醇后,小鼠先表現(xiàn)出興奮狀態(tài),繼而行走不穩(wěn),搖擺,四肢癱軟,轉(zhuǎn)身困難,半小時后重者嗜睡、醉倒,呼吸急促,此狀態(tài)一直持續(xù)1h左右。空白組小鼠精神良好,食欲旺盛,毛色光滑有光澤;12h后模型組小鼠狀態(tài)普遍較差,精神萎靡不振,毛色粗糙無光澤,活動減少。與模型組相比,陽性對照組、RPBA各劑量組小鼠精神狀態(tài)、毛色和光澤有著顯著改善,這說明RPBA對酒精性損傷有一定的保護(hù)作用。

    2.2 RPBA對小鼠腎損傷后SOD、GSH-Px、CAT的活性影響

    由表2可見,造模后腎組織中SOD、GSH-Px、CAT的活性均明顯低于空白對照組(p<0.01),給予RPBA后,SOD、CAT活性呈劑量-效應(yīng)關(guān)系增加,其中中、高劑量組SOD活性已與空白對照組基本相當(dāng),高劑量組CAT活性已與藥物組水平相當(dāng);GSH-Px活性雖未達(dá)到藥物組水平,但隨著多糖劑量的上升,GSH-Px的活性逐漸上升,呈一定的量效關(guān)系。說明RPBA能顯著提高小鼠腎臟SOD、GSH-Px、CAT活性,增強(qiáng)機(jī)體清除自由基、H2O2的能力,減輕其對小鼠腎臟的損害作用。

    表2 RPBA對小鼠腎SOD、GSH-Px、CAT活性的影響(x±s,n=10)Table 2 Effect of RPBA on SOD、GSH-Px、CAT activity inkidney of mice(x±s,n=10)

    2.3 RPBA對小鼠腎損傷后GSH和MDA含量的影響

    表3 RPBA對小鼠腎GSH和MDA含量的影響(x±s,n=10)Table 3 Effect of RPBA on GSH and MDA contents in kidney of mice(x±s,n=10)

    由表3可見,造模后小鼠腎臟GSH水平顯著低于空白對照組(p<0.01),給予RPBA后,雖未達(dá)到藥物組水平,但低、中、高劑量組GSH水平均有所增加,并呈一定劑量關(guān)系,說明RPBA能一定程度地提高腎損傷小鼠非酶體系的抗氧化能力;造模后模型組MDA水平高于空白組,呈顯著性差異(p<0.01),給予RPBA后,多糖各劑量組MDA水平均有顯著降低,其中高劑量組達(dá)到空白對照組水平,說明RPAB能有效改善腎損傷小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平。

    3 討論

    自由基學(xué)說認(rèn)為,自由基的增多是產(chǎn)生衰老和死亡的重要因素。在正常的生物代謝過程中,細(xì)胞會產(chǎn)生O2-·等自由基,它們可以迅速地被細(xì)胞內(nèi)的防御系統(tǒng)所消除,不造成危害。但在某些異常因素如放射性物質(zhì)、藥物、酒精等的影響下均會引發(fā)正常代謝外的異常自由基反應(yīng),這些異常自由基反應(yīng)產(chǎn)生的大量自由基不能完全被防御系統(tǒng)所清除,因而就會在細(xì)胞內(nèi)積累并擴(kuò)散至細(xì)胞外,氧化蛋白質(zhì)、核酸和脂肪,從而損害細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。近期研究[19-21]認(rèn)為,自由基與造成腎臟損傷的機(jī)制有關(guān),深入研究食用菌多糖對體內(nèi)自由基清除活性,將有助于開發(fā)天然高效抗氧化物質(zhì)。

    機(jī)體內(nèi)的自由基清除率防御體系主要由抗氧化酶體系和非酶體系組成。SOD、GSH-Px、CAT三種酶組成生物體最主要的抗氧化酶防御體系。它們能有效清除活性氧自由基,終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),在抗氧化方面起了重要作用。當(dāng)這些酶活性降低時,會導(dǎo)致自由基積累,破壞細(xì)胞膜的完整性,并引起功能的喪失[22]。GSH是非酶體系中重要的還原產(chǎn)物,它能迅速清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基,有效地防止脂質(zhì)過氧化[23]。MDA是體內(nèi)自由基攻擊脂質(zhì)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物的代謝最終產(chǎn)物,可間接反映出細(xì)胞損傷的程度[24]。

    食用菌多糖能從整體上提高機(jī)體免疫力,尤其是抗氧化,保護(hù)生物膜和延緩衰老作用。國內(nèi)外關(guān)于食用菌多糖抗氧化活性方面的報道已經(jīng)很多,如有平菇多糖、云芝多糖、金頂側(cè)耳多糖、香菇多糖、茶樹菇多糖、雙孢菇多糖、姬菇多糖、猴頭菇多糖等等[25-32],其中金頂側(cè)耳多糖能顯著提高腎損傷小鼠的SOD等抗氧化酶活性和GSH含量,姬菇多糖在降低腎損傷小鼠MDA水平方面有很好的作用。與上述研究結(jié)果一致,本實驗顯示黑牛肝菌多糖能提高SOD、CAT、GSH-Px的活性,增加腎組織GSH含量,降低腎勻漿MDA含量。其機(jī)制可能是RPBA預(yù)處理可以提前增強(qiáng)機(jī)體的自由基清除防御體系,可以有效地拮抗急性酒精所導(dǎo)致的抗氧化酶活性降低及GSH耗竭,抑制自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),增強(qiáng)脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)代謝,保護(hù)細(xì)胞膜,促進(jìn)細(xì)胞的再生和修復(fù)。實驗結(jié)果說明黑牛肝菌多糖在預(yù)防自由基誘發(fā)氧化腎臟組織損傷方面,是具有開發(fā)前景的一種天然的高效抗氧化劑。

    4 結(jié)論

    從小鼠一般情況觀察,模型組小鼠精神萎靡不振,毛色粗糙無光澤,活動減少,狀態(tài)普遍較差;而飼喂RPBA各劑量組的小鼠精神狀態(tài)、毛色和光澤有著顯著改善。

    從體內(nèi)抗氧化方面分析,模型組小鼠腎臟抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT酶活性下降,抗氧化物質(zhì)GSH含量減少,脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA含量增加;而飼喂RPBA各劑量組的小鼠腎臟抗氧化酶SOD、GSHPx和CAT酶活性顯著升高(p<0.01),且存在一定的劑量關(guān)系,GSH含量隨RPBA劑量的增加逐步恢復(fù)到正常水平;MDA含量顯著降低(p<0.01)。說明RPBA能顯著提高腎臟中抗氧化酶活性,減少脂質(zhì)過氧化,對小鼠酒精性腎損傷具有明顯的保護(hù)作用。

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