非白色假絲酵母菌代謝產物對人臍靜脈內皮細胞株ECV304細胞增殖的誘導作用

陳斌 車團結 白德成 何祥一

[摘要] 目的 研究3種常見的非白色假絲酵母菌對人臍靜脈內皮細胞株ECV304細胞增殖及細胞周期的影響。方法 制備熱帶假絲酵母菌、克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌上清液并行倍比稀釋，設1、4、16倍3個稀釋度以及對照組。體外培養(yǎng)ECV304細胞，分別將3種非白色假絲酵母菌不同稀釋度的上清液與ECV304細胞共培養(yǎng)，采用MTT法測定培養(yǎng)24、48、72 h后的細胞增殖率；倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)48 h后細胞密度的變化；流式細胞術測定培養(yǎng)48 h后對ECV304細胞周期的影響。結果 培養(yǎng)24 h后，3種假絲酵母菌1倍稀釋的上清液均可促進細胞增殖，4倍稀釋的克魯斯假絲酵母菌也可促進細胞增殖（P<0.05）；培養(yǎng)48、72 h后，克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌上清液仍可促進ECV304細胞增殖，而熱帶假絲酵母菌上清液無論稀釋度高低均不能促進ECV304細胞增殖。培養(yǎng)48 h后，克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌上清液組的細胞密度明顯增高，同時其G0/G1期細胞所占比例降低，細胞增殖指數(shù)（PI）升高（P<0.05）；而熱帶假絲酵母菌組的細胞密度和PI均無明顯變化（P>0.05）。結論 克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌的代謝產物對ECV304細胞的增殖有誘導作用，臨床上應加強非白色假絲酵母菌感染的檢測和治療。

[關鍵詞] ECV304細胞； 非白色假絲酵母菌； 增殖； 代謝產物

[中圖分類號] R 780.2 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.018

假絲酵母菌（Saccharomyces）是一種條件致病菌，常分布在人體的腸道、泌尿道、皮膚和口咽黏膜等處。當宿主存在營養(yǎng)攝入不足、免疫力降低，以及長期配戴義齒等誘發(fā)因素時，易引起口腔黏膜感染假絲酵母菌，發(fā)生口腔假絲酵母菌病[1-2]。近年來，

隨著免疫抑制劑、細胞毒性藥物、廣譜抗生素的廣泛應用，器官移植術及導管介入等各種治療方法的開展，以及獲得性免疫缺陷綜合征、糖尿病、惡性腫瘤等疾病患病率的升高，由此導致的宿主免疫功能低下或菌群失調人群的增多，使得口腔假絲酵母菌感染率迅速上升[3-4]。在能引起人類感染的假絲酵母菌中，白色假絲酵母菌（Saccharomyces albicans）

是最主要、最常見的致病菌[3，5]；但是，近年來假絲酵母菌病的致病菌譜有所變遷，由非白色假絲酵母菌引起的感染不斷增加。

本課題組前期研究[6]表明：白色假絲酵母菌的代謝產物是重要的致病成分，可引起人臍靜脈內皮細胞ECV304的增殖。為進一步探討非白色假絲酵母菌在口腔中的致病作用，本研究采用3種常見的非白色假絲酵母菌代謝產物與體外培養(yǎng)的ECV304細胞共培養(yǎng)，觀察其對細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

熱帶假絲酵母菌（Saccharomyces tropicalis）ATCC 750、克魯斯假絲酵母菌（Saccharomyces krusei）ATCC 6258、光滑假絲酵母菌（Saccharomyces glabrata）CC-UG 32725，由芬蘭赫爾辛基大學口腔醫(yī)學研究院惠贈。人臍靜脈內皮細胞株ECV304購自中國科學院上海藥物研究所。MTT（Sigma公司，美國）；RPMI 1640培養(yǎng)液（Gibco公司，美國），胎牛血清（杭州四季青

生物工程材料有限公司），胰蛋白酶（Gibco公司，美

國）。

1.2 方法

1.2.1 假絲酵母菌上清液的制備 3種假絲酵母菌在37 ℃沙堡氏液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48 h后，用高壓滅菌PBS稀釋各菌液，至OD600為1.00±0.05時，將菌液置于7 000 r·min-1、4 ℃條件下離心20 min。取上清液，采用0.22 μm濾膜過濾除菌，超聲破碎，再用0.22 μm濾膜二次過濾除菌后得到假絲酵母菌上清液，備用。

1.2.2 實驗分組 實驗組：熱帶假絲酵母菌組、克魯斯假絲酵母菌組和光滑假絲酵母菌組的上清液分別用PBS倍比稀釋，設1、4、16倍共3個稀釋度。對

照組：3組加入等量PBS。

1.2.3 ECV304細胞傳代培養(yǎng) 復蘇凍存的ECV304細胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2、95%空氣及飽和濕度條件下培養(yǎng)。當細胞長滿瓶壁的75%以上時傳代，收獲指數(shù)生長期的ECV304細胞，備用。

1.2.4 ECV304細胞增殖率的測定 用完全培養(yǎng)液調整細胞密度至每毫升1×105個，接種于96孔板，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h待細胞完全貼壁進入對數(shù)生長期后，將熱帶假絲酵母菌、克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌倍比（1、4、16倍）稀釋的上清液10 μL分別加入細胞培養(yǎng)孔中，每孔10 μL；對照組加入PBS，每孔10 μL。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入5 g·L-1的MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate， SDS）液120 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，置于酶聯(lián)免疫檢測儀上測定570 nm處的吸光度A值。每組設5個平行孔，實驗重復3次。細胞增殖率（%）=（實驗組A值-對照組A值）/對照組A值×100%。

1.2.5 ECV304細胞密度的變化 將ECV304細胞制成密度為每毫升5×104個細胞的細胞懸液，接種在6孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h后每孔分別加入200 μL 1倍稀釋的熱帶假絲酵母菌、克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌的上清液，以等體積PBS作為對照。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡下觀察ECV304細胞密度的變化。

1.2.6 ECV304細胞周期的變化 用完全培養(yǎng)液調整ECV304細胞密度為每毫升5×104個，每瓶加入10 mL細胞懸液，培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁進入對數(shù)生長期后，更換完全培養(yǎng)液，分別加入1 mL 1倍稀釋的熱帶假絲酵母菌、克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌的上清液。另設加入1 mL PBS的組為對照組。每組設3個平行。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，2.5 g·L-1胰酶消化收集細胞，采用流式細胞儀檢測細胞DNA的周期性變化，分析各組G0/G1期、S期、G2/M期細胞的百分數(shù)，并計算細胞的增殖指數(shù)（proliferation index，PI）。PI（%）=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%。

1.2.7 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，結果采用x±s表示，分別對各實驗組進行單因素方差分析，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 非白色假絲酵母菌上清液對ECV304細胞增殖作

用的影響

不同稀釋度的3種非白色假絲酵母菌上清液作用ECV304細胞不同時間后，對ECV304細胞增殖作用的影響見表1、2。作用24 h時，3種假絲酵母菌1倍稀釋的上清液作用EVC304細胞均可促進細胞增殖，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；4倍稀釋時，僅有克魯斯假絲酵母菌上清液可以促進細胞增殖，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；16倍稀釋時，3種菌均無促細胞增殖作用，與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

作用48 h時，與對照組相比，克魯斯假絲酵母菌所有稀釋度的上清液均可促進細胞增殖（P<0.01）；光滑假絲酵母菌上清液在1倍和4倍稀釋時，可明顯促進細胞增殖（P<0.05），但在16倍稀釋時無明顯作用（P>0.05）；而熱帶假絲酵母菌3種稀釋度的上清液對細胞促增殖作用均不明顯（P>0.05）。

作用72 h時，光滑假絲酵母菌各稀釋度上清液均可促進ECV304細胞增殖，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；克魯斯假絲酵母菌上清液在1倍和4倍稀釋時，可明顯促進細胞增殖，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），但在稀釋16倍時無

明顯促增殖作用（P>0.05）；熱帶假絲酵母菌3種稀釋度的上清液均無明顯的促增殖作用，與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

細胞增殖率結果顯示：克魯斯假絲酵母菌1倍和

4倍稀釋的上清液，以及光滑假絲酵母菌1、4和16倍稀釋的上清液都是在培養(yǎng)72 h時促細胞增殖的作用最強。

2.2 非白色假絲酵母菌上清液對ECV304細胞密度變

化的影響

ECV304細胞經3種假絲酵母菌上清液處理48 h后的細胞密度見圖1。與對照組（圖1a）相比，熱帶假絲酵母菌上清液組（圖1b）的細胞密度無明顯變化；克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌上清液組（圖1c和圖1d）的細胞密度明顯高于熱帶假絲酵母菌上清液組

與對照組。

2.3 非白色假絲酵母菌上清液對ECV304細胞周期的

影響

3種非白色假絲酵母菌上清液在作用ECV304細胞48 h后，各組細胞周期時相的測定結果見表3。與對照組相比，3個實驗組S期細胞所占比例均升高；克魯斯假絲酵母菌組和光滑假絲酵母菌組G0/G1期細胞所占比例較對照組均降低，而反映細胞增殖活力的指數(shù)PI均升高；上述差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

熱帶假絲酵母菌組G0/G1期細胞所占比例和PI與對照組相比均無明顯變化（P>0.05）。

3 討論

假絲酵母菌是口腔常見的共生菌，在健康人群中的檢出率將近50%[7]。但是有學者[8]認為口腔假絲

酵母菌感染與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。9%～40%的口腔癌癥患者可并發(fā)假絲酵母菌白斑，而其中2%～6%的白斑可發(fā)生惡變[9]。研究[10]證實：侵入的口腔假絲酵母菌能引起口腔上皮的增生。Barrett等[11]認

為：假絲酵母菌感染與中、重度上皮增生甚至惡變密切相關。有學者[12]利用口腔假絲酵母菌與口腔上皮細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)假絲酵母菌可引起口腔上皮細胞的細胞周期發(fā)生改變， 細胞增殖活力升高。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅僅取決于口腔黏膜上皮細胞，也與口腔黏膜下血管內皮細胞密切相關。血管內皮細胞能快速增生、遷移形成腫瘤新生血管，是腫瘤血管生成的靶細胞，可以為腫瘤的發(fā)展運輸養(yǎng)分并排出代謝產物；此外，新生的血管內皮細胞可以分泌某些生長因子以促進腫瘤細胞的生長與移動。腫瘤的增長速度在很大程度上取決于營養(yǎng)的供應。當腫瘤體積超過2 mm3左右時，已不能單純依靠彌散方式獲取氧氣及營養(yǎng)物質，此時若無新生毛細血管長入，腫瘤組織將處于休眠狀態(tài)或發(fā)生退化[13]。

目前已有研究[14]從體外實驗和動物實驗等方面

探討了白色假絲酵母菌的致病潛力，認為該菌是最常見、致病性最強的一種口腔假絲酵母菌。本課題組前期研究[6]顯示：白色假絲酵母菌代謝產物可引起

ECV304細胞的增殖，是重要的致病成分。有研究[8，15]發(fā)現(xiàn)：白色假絲酵母菌與口腔腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。同時，非白色假絲酵母菌例如光滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、克魯斯假絲酵母菌等也是主要的致病菌[16]。近年來，致病性假絲酵母菌的菌譜

有所變遷，即由非白色假絲酵母菌引起的感染不斷增加，而針對非白色假絲酵母菌代謝產物致病性的研究還較少。ECV304細胞是通過分離健康產婦正常娩出的胎盤游離端臍帶的臍靜脈得到的永生血管內皮細胞株，早在1984年國外已有學者應用其進行感染菌與宿主細胞交互作用方面的實驗探索[17]。

本研究結果顯示：利用非白色假絲酵母菌上清液與細胞共培養(yǎng)，在不同培養(yǎng)時間（24、48、72 h）

和不同稀釋度作用下，3種非白色假絲酵母菌上清液促進ECV304細胞增殖的作用有所不同。短時間（24 h）作用后，3種菌的1倍稀釋上清液以及克魯斯

假絲酵母菌的4倍稀釋上清液可促進細胞增殖。長時間（48、72 h）作用后，高稀釋度的克魯斯假絲酵母菌上清液（16倍稀釋，48 h）和光滑假絲酵母上清液（16倍稀釋，72 h）仍有促進ECV304細胞增殖的作用，而熱帶假絲酵母菌上清液無論稀釋度高低均不能促進ECV304細胞增殖；細胞增殖率結果顯示：克魯斯假絲酵母菌1倍和4倍稀釋的上清液，以及光滑假絲酵母菌1、4和16倍稀釋的上清液都是在培養(yǎng)72 h時促細胞增殖的作用最強。

高稀釋度的克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌在長時間作用細胞后仍可促進細胞增殖這一結果，與本課題組前期對白色假絲酵母菌的研究結果[6]有

所不同，提示克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌的代謝產物可能不同于白色假絲酵母菌，前兩種菌的代謝產物能分解或轉化成促細胞增殖作用更大的毒性物質。該結果提示臨床上對于假絲酵母菌長期慢性感染的患者，更應注重克魯斯假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌的防治和監(jiān)測。

增殖旺盛的細胞處于S期和G2/M期的比例較高。本研究結果顯示：克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌上清液組G0/G1期細胞所占比例均降低，而反映細胞增殖活力的指數(shù)PI均升高；熱帶假絲酵母菌組則無明顯變化。這說明克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌上清液可促進細胞增殖，而熱帶假絲酵母菌上清液的促增殖作用不明顯。

有研究[18]顯示：腫瘤血管內皮細胞的表型及功

能特性與正常靜止的血管內皮細胞具有明顯差異，腫瘤血管內皮細胞呈不成熟及快速分裂狀態(tài)，與正常組織的血管內皮細胞相比，其增殖活性可增高20～

2 000倍。本研究結果說明：除了最常見、致病性最強的白色假絲酵母菌以外，克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌的代謝產物也可誘導口腔黏膜上皮深層的血管內皮細胞增殖，促進口腔腫瘤的發(fā)生和發(fā)展?？刂瓶谇患俳z酵母菌感染，首選氟康唑、伊曲康唑等藥物，但是假絲酵母菌對此類藥物特別是氟康唑耐藥性的增強，已越來越引起關注[3]。近年來，非白色假絲酵母菌引起的感染不斷增加，而且克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌對此類抗真菌藥并不敏感[2]。在進行白色假絲酵母菌相關研究的同時，也要重視對非白色假絲酵母菌特別是克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌致病機理的研究和新型特異性藥物的研制，加強臨床上非白色假絲酵母菌感染的檢測和治療。

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（本文編輯 吳愛華）