Osterix過(guò)表達(dá)對(duì)人牙周膜細(xì)胞骨向分化的影響

趙艷紅　李洪發(fā)　王春玲　楊強(qiáng)　鄭朝　付雅麗

[摘要] 目的 研究Osterix（Osx）過(guò)表達(dá)對(duì)人牙周膜細(xì)胞受力后骨向分化的影響，探討Osx與正畸牙周組織骨改建的關(guān)系。方法 采用組織塊法培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞，用重組質(zhì)粒pcDNA3.1 flag-Osx轉(zhuǎn)染人牙周膜細(xì)胞。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和Western blot方法檢測(cè)未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染Osx組細(xì)胞Osx mRNA和蛋白表達(dá)水平；并觀察核心結(jié)合因子α1（Cbfα1）、堿性磷酸酶（ALP）、骨橋素（OPN）、骨鈣素（OC）、骨涎蛋白（BSP）和a1（Ⅰ）型膠原蛋白（Col Ⅰ）的mRNA表達(dá)情況。3組細(xì)胞加載6 h離心力后，觀察上述檢測(cè)指標(biāo)的變化。結(jié)果 轉(zhuǎn)染24 h后，相對(duì)未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組Osx mRNA和蛋白水平無(wú)明顯變化（P>0.05）；而轉(zhuǎn)染Osx組Osx mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.01），同時(shí)5個(gè)成骨標(biāo)志基因的mRNA表達(dá)亦均明顯升高（P<0.05，P<0.01）。加力6 h后，3組Osx和成骨標(biāo)志基因表達(dá)水平均明顯升高，但是轉(zhuǎn)染Osx組Osx mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)更加顯著，增加量約為其他兩組的2倍，其ALP、OPN、OC、BSP和Col Ⅰ的mRNA表達(dá)亦升高更顯著。結(jié)論 Osx過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞在機(jī)械力作用下向成骨樣細(xì)胞分化。Osx可能通過(guò)調(diào)控多種成骨基因的表達(dá)，從而在正畸牙周組織的骨改建過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

[關(guān)鍵詞] Osterix； 過(guò)表達(dá)； 人牙周膜細(xì)胞； 機(jī)械刺激； 成骨分化

[中圖分類號(hào)] Q 78 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.021

牙周膜細(xì)胞在機(jī)械力的誘導(dǎo)下分化為成骨細(xì)胞[1]，參與骨吸收和骨形成，是正畸骨改建的關(guān)鍵。牙周膜細(xì)胞通過(guò)特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)機(jī)械力作出反應(yīng)，引發(fā)一系列細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)。此過(guò)程涉及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，近年來(lái)少數(shù)研究[2-4]發(fā)現(xiàn)：一些核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子參與了牙周膜細(xì)胞內(nèi)調(diào)控途徑，在將細(xì)胞外物理或機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為協(xié)調(diào)的細(xì)胞反應(yīng)方面發(fā)揮著積極的調(diào)控作用。

Osterix（Osx）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的骨形成轉(zhuǎn)錄因子，它是成骨細(xì)胞分化和骨形成不可缺少的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，是間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化所必需的[5]。近年來(lái)少量研究[5-7]發(fā)現(xiàn)：Osx在牙胚、造釉細(xì)胞瘤牙源性組織中均有陽(yáng)性表達(dá)，表明Osx可能在牙齒、牙周組織的發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。筆者前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了在體外機(jī)械力作用下人牙周膜細(xì)胞內(nèi)Osx mRNA和蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，參與細(xì)胞的成骨分化[8]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步開(kāi)展了Osx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)及后續(xù)加載實(shí)驗(yàn)，旨在檢測(cè)多種成骨標(biāo)志基因表達(dá)的變化，從而進(jìn)一步明確人牙周膜細(xì)胞受力后骨向分化過(guò)程是否通過(guò)Osx信號(hào)通路，并探討Osx在此過(guò)程中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

質(zhì)粒pcDNA3.1 flag-Osx（由美國(guó)Tufts大學(xué)牙科學(xué)院口腔生物研究所惠贈(zèng)），質(zhì)粒小提試劑盒、限制性內(nèi)切酶（Hind Ⅲ、BamH Ⅰ和Xba Ⅰ）、DNA Marker

（大連寶生物工程有限公司），胰蛋白胨、酵母提取物（Merck公司，德國(guó)），DMEM培養(yǎng)基（高糖）、胰蛋白酶、瓊脂（Sigma公司，美國(guó)），LipofectamineTM2000

轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen公司，美國(guó)），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（杭州四季青生物工程材料有限公司），Trizol（上海Sangon生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司，美國(guó)），Light-Cycler FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ（Roche Applied Science公司，德國(guó)），山羊抗人、鼠Osx多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國(guó)），0.45 μm聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluorid，PVDF）膜（Amersham Bio-sciences公司，瑞典）。

IXZ-ILL100型倒置相差顯微鏡、CX71顯微鏡及照相系統(tǒng)（OLYMPUS公司，日本），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、

臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（Heraeus公司，德國(guó)），梯度聚

合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（Bio-metra公司，德國(guó)），電泳槽、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、制膠器（BIO-RAD公司，美國(guó)）。

1.2 人牙周膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定

取11～14歲青少年因正畸而拔除的牙周健康的前磨牙。采用組織塊法原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞，取第2代細(xì)胞爬片，用免疫組化SP法進(jìn)行波形絲蛋白和角蛋白染色，進(jìn)行來(lái)源鑒定。

1.3 人牙周膜細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染

1.3.1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1 flag-Osx的初步鑒定 利用限制性內(nèi)切酶對(duì)pcDNA3.1 flag-Osx進(jìn)行酶切鑒定。按照試劑盒說(shuō)明，分別利用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ建立單酶切鑒定體系，利用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Xba Ⅰ建立雙酶切鑒定體系，混勻后37 ℃水浴2～3 h。取10 μL上述酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳圖譜，最終確定是否轉(zhuǎn)化成功。

1.3.2 轉(zhuǎn)染人牙周膜細(xì)胞 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2～3代人牙周膜細(xì)胞，按照每孔2.5×105個(gè)接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞融合至80%時(shí)，按陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明操作，用重組質(zhì)粒pcDNA3.1 flag-Osx和空載體質(zhì)粒pcDNA3.1 flag轉(zhuǎn)染人牙周膜細(xì)胞。轉(zhuǎn)染4～5 h后移去轉(zhuǎn)染液，加入DMEM完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后24、48、72 h收集細(xì)胞，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)Osx基因和蛋白表達(dá)情況，并選取培養(yǎng)24 h的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)加力實(shí)驗(yàn)。

1.4 人牙周膜細(xì)胞的體外加力

本研究參照以往的報(bào)道[9]，采用離心加力法對(duì)

細(xì)胞加載機(jī)械力。將分別種有無(wú)轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒（pcDNA3.1 flag）、轉(zhuǎn)染目的基因（pcDNA3.1 flag-

Osx）3組細(xì)胞的6孔板在無(wú)菌條件下用無(wú)菌密封膠密封，置于37 ℃離心機(jī)加力支架中，以離心機(jī)加力（631 r·min-1，約80 g相對(duì)離心力）6 h。此加力方式相當(dāng)于對(duì)人牙周膜細(xì)胞施加接近正畸臨床的持續(xù)壓力，大小約為16 g·cm-2，屬于正畸臨床輕力范圍[8]。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-poly-

merase chain reaction，RT-PCR）

采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，并進(jìn)行質(zhì)量測(cè)定。應(yīng)用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒建立反應(yīng)體系，離心混勻后置于循環(huán)變溫加熱器進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件為：37 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。生成的cDNA置冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

取2 μL cDNA，采用LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ建立反應(yīng)體系，放入LightCy-

cler機(jī)器內(nèi)，按照實(shí)驗(yàn)說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s、55 ℃退火10 s、72 ℃延伸5 s，循環(huán)45次。融解分析產(chǎn)物特異性，電泳鑒定產(chǎn)物大小。以β-actin作為內(nèi)參照，用LightCycler Software Ver. 4.0分析目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)中，除了檢測(cè)Osx mRNA的表達(dá)外，同時(shí)還檢測(cè)了核心結(jié)合因子α1（core-binding fac-tor α1，Cbfα1），成骨標(biāo)志基因堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨橋素（osteopontin，OPN）、骨

鈣素（osteocalcin，OC）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）和a1（Ⅰ）型膠原蛋白（collagen protein a1，ColⅠ）mRNA的表達(dá)，以反應(yīng)細(xì)胞的成骨分化情況。其中所用基因引物序列具體見(jiàn)表1。

1.6 Western blot檢測(cè)Osx蛋白的表達(dá)

收集細(xì)胞約5×106個(gè)，冰上加入適量（200 μL）細(xì)胞裂解液（50 mmol·L-1 Tris-HCl、150 mmol·L-1 NaCl、1%Triton X-100、1 mmol·L-1乙二胺四乙酸、10%丙三醇、0.5 mmol·L-1苯甲基磺酰氟化物、10 μg·mL-1亮肽酶素和1 μg·mL-1抑酞酶），裂解細(xì)胞，低溫離心，獲取全蛋白上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎枚量伤幔╞icinchoninic acid，BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

取等量蛋白樣品，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE），后將蛋白帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉液封閉，加入山羊抗人、鼠Osx多克隆抗體（1∶250）4 ℃過(guò)夜，漂洗后加入用TBS稀釋

的辣根酶標(biāo)記兔抗山羊二抗（1∶2 500），搖動(dòng)反應(yīng)1～2 h進(jìn)行雜交，顯色。實(shí)驗(yàn)以actin作為內(nèi)參照，應(yīng)用JD801圖像分析系統(tǒng)測(cè)定目的條帶的相對(duì)積分光密度，分析Osx蛋白表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 人牙周膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定

倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)，牙周膜組織塊在5～10 d內(nèi)開(kāi)始有細(xì)胞游出，以組織塊為中心呈放射狀排列生長(zhǎng)，20 d爬滿培養(yǎng)瓶。人牙周膜細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，胞體豐滿，胞漿均勻，胞核呈圓形或卵圓形。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，性狀穩(wěn)定，具有成纖維細(xì)胞特性。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果為抗波形絲蛋白陽(yáng)性、抗角蛋白陰性（圖1）。

2.2 表達(dá)載體pcDNA3.1 flag-Osx的酶切鑒定結(jié)果

對(duì)提取的表達(dá)載體pcDNA3.1 flag-Osx進(jìn)行酶切鑒定，凝膠電泳觀察結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，得到的目的片段與預(yù)期片段大小一致：pcDNA3.1 flag-Osx經(jīng)Hind Ⅲ雙酶切得Flag-Osx片段；經(jīng)BamH Ⅰ和

Xba Ⅰ雙酶切得Osx片段（約1 200 bp）。

2.3 轉(zhuǎn)染后Osx基因和蛋白表達(dá)的檢測(cè)

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 flag-Osx后，分別于24、48、72 h抽提總RNA，采用實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染24、48、72 h，Osx mRNA表達(dá)均比未轉(zhuǎn)染時(shí)顯著上調(diào)（P<0.01），24 h時(shí)表達(dá)最高，隨后逐漸降低（圖3）。

轉(zhuǎn)染24 h后，轉(zhuǎn)染Osx組Osx mRNA表達(dá)水平相對(duì)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞明顯升高28.1倍，同時(shí)Osx蛋白亦呈現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)烈表達(dá)（P<0.01）。相反，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的Osx mRNA和蛋白水平相對(duì)未轉(zhuǎn)染組無(wú)明顯變化（P>0.05）。加力6 h后，3組Osx表達(dá)水平均明顯升高，但是相對(duì)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染Osx組Osx mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)更顯著，增加量約為其他兩組的2倍（圖4、5）。

2.4 轉(zhuǎn)染加力后Cbfα1和成骨標(biāo)志基因的表達(dá)變化

轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組相比，Cbfα1及5個(gè)成骨標(biāo)志基因（ALP、OPN、OC、BSP 和Col Ⅰ）的mRNA表達(dá)變化無(wú)明顯差異（P>0.05）。與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，細(xì)胞轉(zhuǎn)染Osx后，Cbfα1 mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化（P>

0.05），但5個(gè)成骨標(biāo)志基因的mRNA表達(dá)均明顯升高（ALP、Col Ⅰ為P<0.05，OPN、OC、BSP為P<0.01）。ALP、OPN、OC、BSP和Col ⅠmRNA表達(dá)水平分別是未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的2.6、3.1、17.6、5.5和2.6倍。加力

6 h后，3組Cbfα1 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化，而ALP、OPN、OC、BSP和Col Ⅰ mRNA的表達(dá)水平均升高（P<

0.05）。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組相比，細(xì)胞受力后5個(gè)成骨標(biāo)志基因變化無(wú)明顯差異（P>0.05）；而轉(zhuǎn)染Osx組與未轉(zhuǎn)染組相比，受力后ALP、OPN、OC、BSP和Col Ⅰ mRNA表達(dá)量升高更顯著（P<0.05）（圖6）。

3 討論

Osx是成骨細(xì)胞分化和骨形成不可缺少的調(diào)節(jié)因子[10]，其調(diào)控許多重要的成骨早晚期表型和功能蛋

白的表達(dá)[5]。Osx過(guò)表達(dá)可以抑制C3H10T1/2、C2C12 細(xì)胞向原來(lái)方向分化，同時(shí)激活OC和Col Ⅰ的表達(dá)，促使細(xì)胞發(fā)生成骨分化。而在Osx基因剔除小鼠胚胎中，各種成骨分化標(biāo)志物的表達(dá)水平嚴(yán)重降低或缺如，成骨細(xì)胞的分化、成熟被完全阻斷[7]。本實(shí)驗(yàn)在

目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及機(jī)械加載前后分別檢測(cè)了5個(gè)成骨標(biāo)志基因mRNA的表達(dá)變化。在成骨分化過(guò)程中，ALP是一組膜結(jié)合糖蛋白，其活性在成骨分化早期即開(kāi)始升高，ALP的表達(dá)是成骨細(xì)胞分化的主要特征之一。OPN是基質(zhì)礦化的調(diào)節(jié)基因[11]，OPN mRNA在

成骨細(xì)胞分化的早期即開(kāi)始表達(dá)；在牙齒發(fā)育中，OPN的表達(dá)早于BSP，可以作為成骨樣細(xì)胞分化的早期標(biāo)志。Col Ⅰ是基質(zhì)礦化支架，通過(guò)整合素受體增加成骨細(xì)胞黏附能力和發(fā)揮促分化作用[12]。BSP是羥

磷灰石結(jié)合形成的起始位點(diǎn)[13]，可以刺激細(xì)胞的增

殖，并促進(jìn)前成骨細(xì)胞分化為骨細(xì)胞。BSP的表達(dá)早于OC，在成熟晚期即開(kāi)始表達(dá)。OC是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，它是成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志[14]，OC mRNA表達(dá)在礦化期開(kāi)始，并逐漸達(dá)到高峰。

本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組相比，ALP、OC、OPN、Col Ⅰ和BSP mRNA表達(dá)未出現(xiàn)變化，排除了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。轉(zhuǎn)染目的基因Osx后，Osx過(guò)表達(dá)未改變Cbfα1基因的表達(dá)，與以往研究結(jié)果相一致，這可能是因?yàn)镺sx位于Cbfα1下游發(fā)揮作用[5]；但Osx過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)了ALP、OPN、BSP、OC和Col ⅠmRNA的表達(dá)。以往研究已證明Osx單獨(dú)作用就足以促使許多重要的成骨細(xì)胞分化早晚期標(biāo)志基因的表達(dá)，發(fā)生礦化反應(yīng)[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明Osx過(guò)表達(dá)通過(guò)增強(qiáng)ALP、OPN、OC、BSP和Col Ⅰ這些成骨標(biāo)志基因的表達(dá)，能夠促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化，進(jìn)而合成骨基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)礦化成骨。正如Osx過(guò)表達(dá)能有效誘導(dǎo)鼠胚胎干細(xì)胞[15]、骨髓基質(zhì)細(xì)胞[16]等分化為成骨細(xì)胞系。OC的顯著上調(diào)部

分說(shuō)明Osx單獨(dú)作用即可誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞發(fā)生終末成骨分化。由此可以推測(cè)，機(jī)械力誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞內(nèi)Osx高表達(dá)同樣也將刺激這些成骨分化早晚期表型和功能基因的表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞發(fā)生成骨分化。因此，從某種程度上來(lái)說(shuō)，機(jī)械刺激誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞的成骨分化需要通過(guò)上調(diào)Osx的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

轉(zhuǎn)染Osx組與未轉(zhuǎn)染組相比較，加力作用6 h后，Osx mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，ALP、OPN、Col Ⅰ、BSP和OC mRNA表達(dá)增強(qiáng)更顯著，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在機(jī)械力誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化過(guò)程中，Osx起著促進(jìn)作用。機(jī)械刺激引起Osx表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而增強(qiáng)成骨標(biāo)志基因的表達(dá)，從而促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化，參與牙周組織改建的骨形成和骨吸收。可見(jiàn)，Osx作為一個(gè)關(guān)鍵的中間環(huán)節(jié)，在機(jī)械力誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞成骨分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大和轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控作用。

體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞的部分表型特征[17]，機(jī)械力單獨(dú)作用即可誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)

胞分化成成骨樣細(xì)胞[18]。近來(lái)研究表明：核內(nèi)轉(zhuǎn)錄

因子參與了細(xì)胞內(nèi)調(diào)控途徑，將細(xì)胞外物理刺激轉(zhuǎn)化為協(xié)調(diào)的細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)[2-5]。本研究結(jié)果表明Osx可能是一條新的信號(hào)傳遞途徑，參與了機(jī)械力誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞成骨分化過(guò)程，這對(duì)正畸牙齒移動(dòng)過(guò)程中的骨改建具有重要作用。當(dāng)然，Osx在此過(guò)程中是否是必需的以及是如何具體發(fā)揮作用的，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。牙周膜細(xì)胞是一個(gè)異質(zhì)性的細(xì)胞群，不僅包含具有分化潛能的成纖維細(xì)胞群體，同時(shí)包含具有多向分化潛能的未分化的成體干細(xì)胞，即牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）。近年來(lái)，隨著人PDLSCs的分離成功和研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)PDLSCs不僅具有較強(qiáng)的克隆形成能力，而且表達(dá)ALP、BSP、OCN等一系列成骨細(xì)胞標(biāo)志物[19]，同時(shí)有研究初步證明張應(yīng)力能夠促進(jìn)PDLSCs向成骨細(xì)胞分化，并推測(cè)PDLSCs可能是在機(jī)械力作用下成骨細(xì)胞分化的主要來(lái)源細(xì)胞，從而介導(dǎo)骨形成和骨吸收[20]。本研究中機(jī)械力加載、Osx過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞系列成骨基因表達(dá)，發(fā)生明顯成骨反應(yīng)，可能與牙周膜細(xì)胞中PDLSCs的存在和發(fā)揮作用密不可分的。當(dāng)然，具體的檢測(cè)和分析還需要借助進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

總之，本研究表明：Osx過(guò)表達(dá)可促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞在機(jī)械力作用下向成骨樣細(xì)胞分化。Osx可能通過(guò)介導(dǎo)和調(diào)控多種成骨基因的表達(dá)，從而在正畸牙周組織的骨改建過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Liu M， Dai J， Lin Y， et al. Effect of the cyclic stretch on the

expression of osteogenesis genes in human periodontal ligament

cells[J]. Gene， 2012， 491（2）：187-193.

[2] Kletsas D， Basdra EK， Papavassiliou AG. Effect of protein kinase

inhibitors on the stretch-elicited c-Fos and c-Jun up-regulation

in human PDL osteoblast-like cells[J]. J Cell Physiol， 2002， 190

（3）：313-321.

[3] Kanno T， Takahashi T， Tsujisawa T， et al. Mechanical stress-me-

diated Runx2 activation is dependent on Ras/ERK1/2 MAPK sig-

naling in osteoblasts[J]. J Cell Biochem， 2007， 101（5）：1266-1277.

[4] Wei F， Wang C， Zhou G， et al. The effect of centrifugal force on

the mRNA and protein levels of ATF4 in cultured human perio-

dontal ligament fibroblasts[J]. Arch Oral Biol， 2008， 53（1）：35-43.

[5] Nakashima K， Zhou X， Kunkel G， et al. The novel zinc finger-

containing transcription factor osterix is required for osteoblast dif-

ferentiation and bone formation[J]. Cell， 2002， 108（1）：17-29.

[6] Hirata A， Sugahara T， Nakamura H. Localization of runx2， osterix，

and osteopontin in tooth root formation in rat molars[J]. J Histo-

chem Cytochem， 2009， 57（4）：397-403.

[7] Kumamoto H， Ooya K. Expression of bone morphogenetic proteins

and their associated molecules in ameloblastomas and adenomatoid

odontogenic tumors[J]. Oral Dis， 2006， 12（2）：163-170.

[8] 趙艷紅， 李洪發(fā)， 王春玲， 等. 機(jī)械力作用下人牙周膜細(xì)胞Osterix

mRNA和蛋白的表達(dá)[J]. 華西口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2010， 28（2）：214-

218.

Zhao Yanhong， Li Hongfa， Wang Chunling， et al. Expression of

Osterix mRNA and protein levels in cultured human periodontal

ligament cells after mechanical stimulation[J]. West China J Sto-

matol， 2010， 28（2）：214-218.

[9] Redlich M， Asher Roos H， Reichenberg E， et al. Expression of

tropoelastin in human periodontal ligament fibroblasts after simu-

lation of orthodontic force[J]. Arch Oral Biol， 2004， 49（2）：119-

124.

[10] Ohyama Y， Nifuji A， Maeda Y， et al. Spaciotemporal association

and bone morphogenetic protein regulation of sclerostin and osterix

expression during embryonic osteogenesis[J]. Endocrinology， 2004，

145（10）：4685-4692.

[11] Sodek J， Ganss B， McKee MD. Osteopontin[J]. Crit Rev Oral Biol

Med， 2000， 11（3）：279-303.

[12] 余希杰， 楊志明， 屈藝， 等. Ⅰ型膠原及其受體系統(tǒng)在成骨細(xì)胞

內(nèi)的表達(dá)[J]. 中國(guó)修復(fù)重建外科雜志， 2000， 14（4）：234-236.

Yu Xijie， Yang Zhiming， Qu Yi， et al. Expression of type Ⅰcol-

lagen and its receptor system in osteoblasts[J]. Chin J Reparative

Reconstructive Surg， 2000， 14（4）：234-236.

[13] Saito Y， Yoshizawa T， Takizawa F， et al. A cell line with charac-

teristics of the periodontal ligament fibroblasts is negatively re-

gulated for mineralization and Runx2/Cbfa1/Osf2 activity， part of

which can be overcome by bone morphogenetic protein-2[J]. J Cell

Sci， 2002， 115（Pt 21）：4191-4200.

[14] Fujisawa R， Tamura M. Acidic bone matrix proteins and their roles

in calcification[J]. Front Biosci， 2012， 17：1891-1903.

[15] Tai G， Polak JM， Bishop AE， et al. Differentiation of osteoblasts

from murine embryonic stem cells by overexpression of the trans-

criptional factor osterix[J]. Tissue Eng， 2004， 10（9/10）：1456-1466.

[16] Tu Q， Valverde P， Chen J. Osterix enhances proliferation and os-

teogenic potential of bone marrow stromal cells[J]. Biochem Bio-

phys Res Commun， 2006， 341（4）：1257-1265.

[17] 李小彤， 張丁， 傅民魁. 體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞成骨樣細(xì)胞表

型特征的研究[J]. 口腔正畸學(xué)， 2001， 8（3）：111-114.

Li Xiaotong， Zhang Ding， Fu Minkui. Osteoblast-like characteris-

tics of human periodontal ligament cells in vitro[J]. Chin J Orthod，

2001， 8（3）：111-114.

[18] Yang YQ， Li XT， Rabie AB， et al. Human periodontal ligament

cells express osteoblastic phenotypes under intermittent force loa-

ding in vitro[J]. Front Biosci， 2006， 11：776-781.

[19] 甄蕾， 劉宏偉. 人牙周膜干細(xì)胞的初步鑒定及體外成骨誘導(dǎo)[J].

口腔頜面外科雜志， 2008， 18（5）：318-322.

Zhen Lei， Liu Hongwei. Human periodontal ligament stem cells

differentiation into osteoblasts in vitro[J]. J Oral Maxillofac Surg，

2008， 18（5）：318-322.

[20] 申濤. 動(dòng)態(tài)張應(yīng)力促人牙周膜干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的研究[D].

重慶： 第三軍醫(yī)大學(xué)， 2011.

Shen Tao. Mechanical tension force promotes osteogenic differen-

tiation of human periodontal ligament stem cells in vitro[D]. Chong-

qing： Third Military Medical University， 2011.

（本文編輯 杜冰）