牛胚胎干細胞克隆實驗中添加物及消化液對其效率的影響分析

張福全

胚胎干細胞（ES細胞）是具有全能性的哺乳動物早期胚胎細胞或原始細胞。胚胎干細胞在分化抑制的培養(yǎng)條件下，可以未分化狀態(tài)無限增殖。近年來有關牛類ES細胞分離與克隆的研究已經取得較大進展[1-2]。筆者為探討添加物和消化液對牛胚胎干細胞克隆效率的影響，通過從牛鮮胚內細胞團（ICM）中分離獲得牛類ES細胞后進行克隆，在培養(yǎng)細胞中添加胰島素生長因子和消化液，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 牛胚采集 在自然發(fā)情期，對健康經產黑白花奶牛母進行人工受精后68 d經非手術方法從牛子宮取胚胎。將待采集胚胎的母牛固定在床位上，在尾椎硬膜外腔注射 2% 鹽酸利多卡因麻醉。按規(guī)定方法在沖洗兩側子宮角。沖出的胚胎要在立體顯微鏡下檢查。在100倍實體解剖顯微鏡下觀察受精卵的形態(tài)、色調、分裂球的大小、均勻度、細胞的密度、與透明帶的間隙以及變性情況等[3-4]。

1.2 溶液配制 細胞基礎培養(yǎng)液：DMEM+0.1 mM 2-mercaptoethanol（在此基礎上，添加不同濃度的血清及各種細胞因子）；細胞基礎消化液：胰蛋白酶+EDTA（在此基礎上，兩者濃度有所調整）。

1.2.1 飼養(yǎng)層制備 選取新生健康黑白花牛犢睪丸制備成纖維細胞，取3代內對數生長期MEF， 終濃度10μg/ml 絲裂霉素C處理 3.5 h， D-PBS充分洗滌，消化細胞調整細胞濃度為1×105個/ml，種植在經 0.1%明膠包被的4孔培養(yǎng)板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)待用，用前更換成胚胎干細胞培養(yǎng)基。

1.2.2 胚胎處理和胚胎培養(yǎng)條件 基礎培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)基+15%NBS+0.1mmol/L 0.1 μmol/L Na2SeO3+β琉基乙醇。室溫下培養(yǎng)牛胚胎及ES細胞。

1.2.3 ICM初次傳代 將ICM細胞體外培養(yǎng)6~7 d后，當細胞繁殖到一定數目時，選擇未分化的細胞進行傳代。操作如下：用玻璃針剝離覆蓋在ICM表面的滋養(yǎng)層細胞后挑出ICM，用PBS洗滌液清洗后，置入0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液中處理后，將細胞轉入15%的血清培養(yǎng)液中，制備細胞團懸混液。培養(yǎng)條件同上。

1.2.4 牛ES細胞繼代克隆 ICM細胞培養(yǎng)35 d后，飼養(yǎng)層表面可出現類似ES細胞的集落。棄去培養(yǎng)液，用PBS液洗滌集落，再用玻璃針剝脫隆起明顯、排列緊密的ES細胞集落，再用毛細吸管將集落移入培養(yǎng)液中。

1.3 研究方法 在DMEM培養(yǎng)基中加入10 ng/ml的IGF（設為IGF組）觀察牛ES細胞的克隆結果與未加IGF（設為對照組）時做比較，在離散ICM和ES集落時，分別用0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液（A組）和0.04%EDTA消化液+0.25%胰蛋白酶消化液（B組），作用時間控制為2 min，溫度37 ℃。

1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0統計學軟件對數據進行統計處理，計數資料采用字2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

不同條件對牛ES細胞克隆的影響情況，具體結果見表1。

表1 不同條件對牛ES細胞克隆的影響

3 討論

胚胎干細胞具有全能性，能再體外條件下分化為各器官系統細胞，亦可在分化抑制的情況下進行未分化狀態(tài)克隆，胚胎干細胞克隆技術廣泛運用于轉基因動物、嵌合體的制作和克隆動物的生產，目前有關牛胚胎克隆的研究取得了重大進展[4-5]。為探討不同條件對牛ES細胞克隆的影響，筆者探討了在不同濃度消化液及在胰島素生長因子作用下，牛ES細胞克隆的變化。牛ES細胞在以上配置的培養(yǎng)液中培養(yǎng)形成ES細胞集落胚數/枚ES 2枚，細胞最大傳代數2代。在培養(yǎng)液中加入10 ng/ml的IGF牛ES細胞集落胚數為3枚，細胞最大傳代數4代，可見IGF對牛ES細胞克隆有促進作用。在ICM細胞與ES細胞分離時用0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液處理2 min，形成ES細胞集落胚數/枚ES 9枚細胞最大傳代數4代。用0.04%EDTA消化液+0.25%胰蛋白酶消化液分離牛ES細胞集落胚數為8枚，細胞最大傳代數4代。因此，在分離ICM細胞和ES細胞時注意，選擇適當濃度的消化液，且作用時間不宜過長[6-8]。通過本實驗可得出在進行牛ES細胞培養(yǎng)時，可利用一定的添加物促進ES細胞克隆，促進其繁殖，而對于分離ICM和ES細胞的消化液，須嚴控其濃度和作用時間。

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