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    桃果實(shí)PpCuZnSOD基因的原核表達(dá)、純化與鑒定

    2013-05-07 03:14:06吳軍帥叢麗君等
    果樹學(xué)報(bào) 2013年2期
    關(guān)鍵詞:純化原核表達(dá)鑒定

    吳軍帥 叢麗君等

    摘 要: 【目的】為了實(shí)現(xiàn)桃銅鋅超氧化物歧化酶在大腸桿菌中的高效表達(dá),獲得表達(dá)穩(wěn)定、蛋白純度高、活性強(qiáng)的工程菌,【方法】將前期獲得的PpCuZnSOD基因(GenBank登錄號(hào):JX217743)重組到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中,并轉(zhuǎn)化到Escherichia coli BL21(DE3)宿主菌,經(jīng)IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting 檢測(cè),鎳柱親和層析純化,并采用Brad Ford 方法測(cè)定融合蛋白濃度,黃嘌呤氧化法分析其酶活。【結(jié)果】成功的構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-32a(+)-PpCuZnSOD,并獲得分子質(zhì)量約為35 kDa的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物,純化后融合蛋白濃度為183.7 mg·L-1,活性為5.23×103 U·mg-1。 【結(jié)論】成功構(gòu)建了桃pET-32a(+)-PpCuZnSOD原核表達(dá)載體,表達(dá)量高、穩(wěn)定性強(qiáng),重組表達(dá)產(chǎn)物具有較高CuZnSOD酶活性,為桃CuZnSOD酶的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞: 桃; PpCuZnSOD; 原核表達(dá); 純化; 鑒定

    中圖分類號(hào):S662.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1009-9980?穴2013?雪02-0185-06

    超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)在植物中普遍存在, 具有清除自由基、維持活性氧代謝平衡、保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的功能、延緩器官衰老過程的作用[1]。根據(jù)酶活性中心的輔基部位結(jié)合的金屬離子的不同,SOD可分為3 種類型:CuZnSOD、MnSOD和FeSOD[2],其中CuZnSOD是3種歧化酶中含量最豐富的一種,是活性氧清除酶系統(tǒng)中最重要的酶,具有減輕膜脂過氧化的作用。大量研究發(fā)現(xiàn),提高植物體內(nèi)抗氧化酶活性和增強(qiáng)抗氧化代謝的水平是提高植物抗逆性的有效途徑[3-6]。SOD的研究受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[7]。前人對(duì)草莓[8]、番荔枝[9]、桃[10]等果實(shí)成熟軟化的研究表明,SOD酶活性與果實(shí)硬度密切相關(guān);此外SOD在醫(yī)療保健方面和食品加工等方面也具有重要作用,CuZnSOD 是一種療效廣泛的藥用酶,在適當(dāng)?shù)臈l件下,補(bǔ)充外源SOD能調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝、提高人體的免疫功能,能夠有效的防治某些疾病和延緩衰老,SOD作為保鮮劑、抗氧化劑以及功能食品的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑在食品加工方面也有著廣闊的應(yīng)用前景[11-12]。

    近年來, 對(duì)幾種主要模式生物SOD基因的克隆、功能分析以及蛋白質(zhì)表達(dá)已進(jìn)行了深入的研究[13],在陸地棉[14]、野桑蠶[15]、楊梅[16]和珍珠粟[17]等植物中發(fā)現(xiàn)的CuZnSOD也實(shí)現(xiàn)了體外表達(dá)。筆者在桃中獲得了包含完整編碼區(qū)的PpCuZnSOD基因(GenBank登錄號(hào):JX217743),在此基礎(chǔ)上,成功構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體pET-32a(+)-PpCuZnSOD, 并在大腸桿菌中得到高效表達(dá),層析純化后獲得具有高活性的CuZnSOD酶,對(duì)進(jìn)一步研究PpCuZnSOD基因的作用功能奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料與試劑

    大腸桿菌 DH5α用于基因克隆,BL21(DE3)作為融合蛋白表達(dá)的宿主,2種大腸桿菌均為實(shí)驗(yàn)室保存。pGEM-PpCuZnSOD 重組質(zhì)粒,PCR產(chǎn)物克隆的載體pGEM-T vector和DNA回收試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司,PCR Kit購(gòu)自Ferments公司,TaKaRa公司的MiniBEST Plasmid KIT Purification質(zhì)粒提取試劑盒,表達(dá)載體 pET-32a(+)購(gòu)自Novagen,限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I以及 T4 DNAligase均購(gòu)自Fermentas;SOD 試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所,Ni-NTA SefinoseTM Kit,DAB顯色試劑盒購(gòu)自生工生物;一抗、二抗購(gòu)自北京博奧森公司。

    1.2 方法

    1.2.1 融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建 1)PpCuZnSOD基因CDS引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增。以克隆得到的PpCuZnSOD基因序列為模板設(shè)計(jì)桃PpCuZnSOD基因CDS的PCR引物,設(shè)計(jì)如下包含BamH I和Xho I識(shí)別位點(diǎn)的引物。PpCuZnSOD-F:5'-CGCGGATCCATGGTGAAGGGCGTTGCTGTT-3',CGCGGATCC為接頭序列,其中CGCG為保護(hù)堿基,GGATCC為BamH I識(shí)別位點(diǎn),并包含了PpCuZnSOD的CDS的起始密碼子ATG;PpCuZnSOD-R:5'-CCGCTCGAGTCAGTTTTGGAGACCAATAAT-3'。CCGCTCGAG為接頭序列,其中 CCGC為保護(hù)堿基,CTCGAG為Xho I的識(shí)別位點(diǎn),TCA為終止密碼子TGA的反向互補(bǔ)序列。以PpCuZnSOD基因連接克隆到pGEM-T vector的菌液為模板,進(jìn)行CDS的PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系:上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,cDNA模板1 μL,2xPCR Master Mix用12.5 μL,終體積25 μL;擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min, 94 ℃ 45 s, 62 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 共35個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,回收連接后轉(zhuǎn)至DH5α,挑取單菌落振蕩培養(yǎng)菌落PCR檢測(cè)后,隨機(jī)挑選5個(gè)條帶大小與預(yù)期相符的單菌落送公司測(cè)序。

    2)質(zhì)粒提取、雙酶切、連接轉(zhuǎn)化及檢測(cè)。提取pGEM- PpCuZnSOD重組質(zhì)粒及pET-32a(+)質(zhì)粒,分別對(duì)pGEM-PpCuZnSOD重組質(zhì)粒及pET-32a(+)進(jìn)行雙酶切反應(yīng):H2O19 μL,10×K buffer O 4.0 μL,質(zhì)粒(重組質(zhì)粒及載體)DNA15.0 μL(約10 μg),BamH I和Xho I各1 μL,37 ℃酶切3 h。

    目的基因酶切產(chǎn)物與表達(dá)載體進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并回收,然后進(jìn)行連接,連接體系為:H2O 27 μL,ligation buffer 1.0 μL,目的基因10.0 μL,表達(dá)載體1.0 μL,T4 DNAligase1.0 μL,16 ℃過夜連接。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH5α涂板培養(yǎng),獲得陽(yáng)性克隆后繼續(xù)培養(yǎng)提取質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)至感受態(tài)BL21(DE3),涂板培養(yǎng)所得到的陽(yáng)性克隆即為pET-32a(+)-PpCuZnSOD重組質(zhì)粒。最后進(jìn)行重組質(zhì)粒的雙酶切檢測(cè)。

    1.2.2 pET-32a(+)-PpCuZnSOD重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 1)樣品的處理。分別從轉(zhuǎn)化組和對(duì)照組的培養(yǎng)液中取1 mL菌液,4 000 r·min-1離心5 min,收集沉淀,加100 μL 1% SDS凝膠加樣緩沖液(1.0 mol·L-1 Tris-HCl(pH 6.8),10%甘油,10%SDS,DTT,0.1%溴酚藍(lán)),劇烈振蕩懸浮,混勻后,沸水浴10 min。迅速冷卻至室溫,4 ℃放置,用于SDS-PAGE分析。

    2)最佳IPTG誘導(dǎo)濃度的篩選。挑取攜帶有pET-32a(+)-PpCuZnSOD表達(dá)載體的BL21(DE3)單菌落培養(yǎng)于3 mL LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素25 mg·L-1)中,37 ℃,200 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜。用含pET-32a(+)質(zhì)粒的BL21(DE3)菌株作為對(duì)照。按1%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接于20 mL LB培養(yǎng)基中(含氨芐青霉素25 mg·L-1),振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.7左右,加IPTG至終濃度分別為0 mmol·L-1、0.1 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、1.0 mmol·L-1,37 ℃,200 r·min-1震蕩培養(yǎng)4 h。

    3)最佳誘導(dǎo)時(shí)間的篩選。加0.5 mmol·L-1 IPTG后分別誘導(dǎo)0 h、2 h、4 h和6 h,用含pET-32a(+)質(zhì)粒的BL21(DE3)菌株作為對(duì)照。

    4)重組蛋白SDS-PAGE分析。表達(dá)蛋白的電泳分離蛋白質(zhì)分離采用垂直板電泳系統(tǒng),分離膠12%,濃縮膠5%,濃縮膠電壓80 V,分離膠電壓120 V。電泳結(jié)束后經(jīng)考馬斯亮蘭染色,再脫色,最后拍照。

    5)重組蛋白的純化、濃度測(cè)定及活性鑒定。按Ni-NTA SefinoseTM Kit的說明進(jìn)行融合蛋白的純化操作;采用Brad ford 方法測(cè)定融合蛋白質(zhì)濃度,以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn);按南京建成生物工程研究所CuZnSOD試劑盒測(cè)定表達(dá)蛋白的活性。

    6)重組蛋白的Western blotting 檢測(cè)。將已表達(dá)的重組蛋白pET-32a(+)-PpCuZnSOD樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上,分別用TBST和TBS洗滌,用封閉液封閉2 h,孵育一抗(在搖床上緩慢搖動(dòng)2 h, 再用TBST和TBS洗滌)及二抗(在搖床上緩慢搖動(dòng)2 h,再用洗滌液洗3 次),最后使用DAB顯色試劑盒顯色。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PpCuZnSOD基因CDS的擴(kuò)增、目的產(chǎn)物與pGEM-T載體的連接

    以pGEM-PpCuZnSOD 重組質(zhì)粒的菌液為模板進(jìn)行CDS的PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示,有且僅有一條亮度很高且大小接近500 bp的條帶,與理論值459 bp相符。將目的條帶回收并進(jìn)行pGEM-T載體連接,轉(zhuǎn)化涂板后同樣進(jìn)行PCR檢測(cè)和測(cè)序證明CDS序列正確。

    2.2 pET-32a(+)-PpCuZnSOD原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)分析

    將PpCuZnSOD基因CDS與pGEM-T載體連接成功的載體進(jìn)行雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳回收CDS片段, pET-32a(+)質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切,連接、轉(zhuǎn)化DH5α、涂板、培養(yǎng)后選取陽(yáng)性克隆繼續(xù)培養(yǎng),提取質(zhì)粒,最后再轉(zhuǎn)入BL21(DE3),獲得陽(yáng)性克隆即為pET-32a(+)-PpCuZnSOD重組載體,做菌液PCR檢測(cè)結(jié)果與圖1基本一致,提取重組質(zhì)粒做雙酶切檢測(cè),如圖2所示,能夠清楚地看出雙酶切產(chǎn)物與圖1的產(chǎn)物大小基本一致,約500 bp。泳道1為對(duì)照pET-32a(+)-PpCuZnSOD重組質(zhì)粒,有2條帶,上者為部分解鏈的環(huán)狀雙鏈態(tài),下者為超螺旋態(tài),雙酶切殘留的線性態(tài)pET-32a(+)質(zhì)粒正好位于2者之間,約大于 5 000 bp,與理論值相符。PCR鑒定與雙酶切鑒定的結(jié)果表明載體已構(gòu)建成功,可用于后續(xù)的PpCuZnSOD原核表達(dá)研究。

    獲得pET-32a(+)-PpCuZnSOD重組載體后,進(jìn)行相應(yīng)的IPTG誘導(dǎo),首先是不同濃度IPTG(0~1 mmol·L-1)誘導(dǎo)4 h,以篩選最佳誘導(dǎo)濃度,然后以最佳誘導(dǎo)濃度0.5 mmol·L-1誘導(dǎo)不同的時(shí)間(0~6 h),進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果如圖3所示,蛋白表達(dá)明顯,IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)空表達(dá)載體pET-32a(+)的大腸桿菌在 20 kDa附近有自身誘導(dǎo)蛋白的表達(dá),IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pET-32a(+)-PpCuZnSOD的大腸桿菌在35 kDa處出現(xiàn)了特異的融合蛋白(圖中已標(biāo)注),此外不同濃度的IPTG對(duì)該表達(dá)載體的表達(dá)影響不顯著,相同濃度IPTG誘導(dǎo)下蛋白的表達(dá)量會(huì)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢增加,但上升趨勢(shì)也不是很明顯。結(jié)果說明pET-32a(+)-PpCuZnSOD重組載體在大腸桿菌中成功表達(dá),并且容易誘導(dǎo),只需要0.1 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)2 h即可。

    參照生工生物公司的Ni-NTA SefinoseTM Kit說明書對(duì)所表達(dá)蛋白進(jìn)行純化,得到較純的融合蛋白條帶采用Brad ford 方法測(cè)定融合蛋白質(zhì)濃度,以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn),設(shè)置不同梯度,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線3次測(cè)定吸光值,計(jì)算所得純化蛋白的濃度約為183.7 mg·L-1。

    分別取未純化蛋白和純化蛋白10 μL(加上樣緩沖液10 μL,共20 μL),進(jìn)行Western blotting 分析進(jìn)一步驗(yàn)證了pET-32a(+)-PpCuZnSOD在大腸桿菌中得到了正確的表達(dá)。利用南京建成生物工程研究所的CuZnSOD試劑盒測(cè)得純化蛋白的活性約為5.23×103 U·mg-1,這說明該基因在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。

    3 討 論

    大量研究表明,果實(shí)成熟衰老與活性氧代謝有關(guān),在果實(shí)后熟衰老時(shí)明顯增加,可能是調(diào)節(jié)果實(shí)成熟衰老的一種重要的自由基[18-19],而SOD恰恰可以清除這種自由基;在植物中過量表達(dá)CuZnSOD 能提高植物的抗逆性[20]。而如何實(shí)現(xiàn)SOD相關(guān)基因的體外表達(dá),甚至實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)是很多人關(guān)注的問題,所以長(zhǎng)久以來,前人們做了很多這方面的工作并且取得了一定的成績(jī)。在西紅柿[21]、楊梅[22]和海灣扇貝[23]中都獲得CuZnSOD的體外表達(dá)蛋白,并且體外活性分別達(dá)到3×105 U·L-1和1.013×106 U·L-1培養(yǎng)基以及1015.36 U·mg-1;在以模式植物為代表的煙草[24]和擬南芥[25]等植物中都獲得MnSOD的體外表達(dá),此外還有部分植物FeSOD的體外表達(dá)[26]。

    桃本身作為呼吸躍變型果實(shí),呼吸高峰之后果實(shí)質(zhì)地發(fā)生明顯改變,果肉腐爛,針對(duì)這種現(xiàn)象,筆者利用表達(dá)載體pET-32a(+)成功表達(dá)了PpCuZnSOD基因的融合蛋白,并實(shí)現(xiàn)了對(duì)融合蛋白的分離純化和活性鑒定,這為系統(tǒng)研究 PpCuZnSOD基因的作用功能、系統(tǒng)進(jìn)化積累了一定的經(jīng)驗(yàn), 也為后續(xù)利用該基因進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

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