HPLC法測定丹膝顆粒中丹參酮ⅡA的含量

李 翔，劉皈陽，馬建麗，周 亮，王 芳

丹膝顆粒由丹參、牛膝、天麻、牡丹皮、赤芍、川芎、地黃、淫羊藿、桑寄生、梔子、決明子、火麻仁等多味中藥組成，具有養(yǎng)陰平肝、熄風通絡、清熱除煩的功能，在心血管疾病的臨床應用較為廣泛。方中丹參為君藥，其中丹參酮ⅡA是丹參藥效作用的主要物質基礎之一，具有顯著的心血管活性［1-3］。目前，丹膝顆粒的質量控制及含量測定方法均未見文獻報道。為了有效評價藥品質量，本試驗參考文獻中丹參酮ⅡA的含量方法，建立HPLC法測定其中丹參酮ⅡA的含量，旨在為制訂丹膝顆粒的質量標準提供參考和借鑒［4-5］。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀(包括四元泵、VWD檢測器、自動進樣器、ChemStation化學工作站);Mettler AE240電子天平;KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器。

丹參酮ⅡA對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110766-200619，供含量測定用);丹膝顆粒(10 g/袋，九芝堂股份有限公司，批號:20110802、20110716、20110808);甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，以甲醇-水(80∶20)為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為270 nm，柱溫為30℃。理論板數(shù)按丹參酮ⅡA峰計不低于5 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取丹參酮ⅡA對照品10.25 mg，置50 mL棕色量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得205.0 μg/mL的對照品儲備液，置4℃冰箱保存。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，稱定重量，超聲處理(功率:150 W，頻率:40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 專屬性試驗 按“2.2”項下方法，制備缺丹參的陰性樣品溶液，按“2.1”色譜條件測定對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液。結果顯示，供試品溶液中丹參酮ⅡA色譜峰與其他色譜峰能達到基線分離，且保留時間與對照品溶液一致，陰性對照溶液在相同保留時間處無色譜峰，表明其他組方藥材味對丹參酮ⅡA的測定無干擾，見圖1。

圖1 丹參酮ⅡA與丹膝顆粒HPLC色譜圖注:A.對照品溶液，B.供試品溶液，C.陰性樣品溶液;1.丹參酮ⅡA

2.4 線性關系考察 精密量取丹參酮ⅡA對照品儲備液1 mL，置10 mL棕色量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得20.50 μg/mL的對照品溶液。精密吸取丹參酮ⅡA對照品溶液1、2、5、10、20、40 μL，按“2.1”色譜條件進樣，測定峰面積。以丹參酮ⅡA進樣量(μg)為橫坐標、峰面積積分值為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程:Y=6 894.52 X-0.29(r=0.999 9，n=6)。結果表明，丹參酮ⅡA在0.020 50～0.820 0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 取對照品溶液10 μL，重復進樣6次。結果丹參酮ⅡA峰面積的RSD為0.27%(n=6)，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣。結果丹參酮ⅡA峰面積的 RSD 為1.81%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗 取同一批號樣品6份(批號:20110802)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，測定丹參酮ⅡA的平均含量為231.3 μg/g，RSD為1.37%(n=6)，表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批號樣品6份(批號:20110802)，精密加入適量丹參酮ⅡA對照品溶液，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別取20 μL進樣測定，計算回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗(n=6)

2.9 樣品含量測定 取3批次樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，20 μL進樣測定。批號為20110802、20110716、20110808 樣品中丹參酮ⅡA的含量分別為 2.313、2.085、2.007 mg/袋。

3 討論

3.1 通過比較乙腈-水和甲醇-水不同體系流動相對樣品中丹參酮ⅡA的分離效果，發(fā)現(xiàn)甲醇-水可以取得令人滿意的色譜峰形和分離效果，分析時間短，試驗成本更為經(jīng)濟。

3.2 考察甲醇、75%甲醇、50%甲醇和水對顆粒劑中丹參酮ⅡA的超聲提取效果，發(fā)現(xiàn)甲醇溶液中的含量最高，這與丹參酮ⅡA脂溶性較強的化學性質一致，故確定甲醇作為提取溶劑。

3.3 從樣品測定圖譜中可以看出，在6 min處有一色譜峰出現(xiàn)，通過與陰性圖譜比較可以確定為來自丹參的化學成分，在后期研究中可以嘗試進行確認，并同時測定2種成分，更利于藥品質量的評價與控制。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［S］.北京:化學工業(yè)出版社，2010:70.

［2］ 楊征，邱敏.丹參酮ⅡA的心血管作用及機制研究進展［J］.中國動脈硬化雜志，2011，19(4):372.

［3］ 張民，張驊，徐鵬，等.丹參酮ⅡA的藥理作用研究進展［J］.醫(yī)藥導報，2008，27(10):1237-1239.

［4］ 李靜.HPLC法測定養(yǎng)心通脈膠囊中丹參酮ⅡA的含量［J］.中國藥師，2011，14(10):1550-1551.

［5］ 侯廣杰.HPLC法測定丹參舒心膠囊中丹參酮ⅡA的含量［J］.安徽醫(yī)藥，2012，16(4):469-470.