湛江地區(qū)養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦冷藏期間的菌相分析及優(yōu)勢(shì)腐敗菌的初步鑒定*

田鳳，王玲

(廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江，524088)

南美白對(duì)蝦(Penaeus vannamei)學(xué)名凡納濱對(duì)蝦，是世界上三大產(chǎn)量最高、品質(zhì)優(yōu)良的對(duì)蝦養(yǎng)殖品種之一。它營(yíng)養(yǎng)豐富、汁鮮肉嫩，且蛋白質(zhì)含量高達(dá)20%，還含有豐富的微量元素和維生素A等成分，深受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛(ài)［1］。由于對(duì)蝦含有大量的水分和豐富的蛋白質(zhì)，捕獲后蝦肉中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如糖、脂、氨基酸等易被微生物分解產(chǎn)生有機(jī)酸、胺類(lèi)以及硫化物等，形成不良的惡臭味甚至有毒物質(zhì)，從而腐敗變質(zhì)失去食用價(jià)值，這些微生物被稱(chēng)為特定腐敗菌(SSO)或優(yōu)勢(shì)腐敗菌［2］。在對(duì)蝦的冷藏過(guò)程中，優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生長(zhǎng)速度比較快，并且會(huì)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解起決定作用。造成對(duì)蝦腐敗的微生物既與自身品種有關(guān)，還與它生長(zhǎng)的水體環(huán)境有關(guān)，湛江作為全國(guó)最大的對(duì)蝦養(yǎng)殖基地，有關(guān)該地區(qū)養(yǎng)殖的南美白對(duì)蝦低溫冷藏保鮮時(shí)的菌相變化和優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離鑒定的相關(guān)資料至今還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)對(duì)湛江地區(qū)養(yǎng)殖的南美白對(duì)蝦冷藏過(guò)程中的菌相分析及優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離和初步鑒定，為該地區(qū)養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦冷藏冷凍保鮮產(chǎn)品貨架期的預(yù)測(cè)和靶向抑菌的保鮮方法提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

鮮活南美白對(duì)蝦:采購(gòu)于湛江東海養(yǎng)殖場(chǎng)。

對(duì)蝦采樣后盡快加氧保活運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，挑取完整鮮活的個(gè)體，加冰猝死，去頭后流水沖洗，然后晾干并隨機(jī)分為7組，分別用保鮮袋包裝后于(4±1)℃條件下保藏。

1.2 試劑

NaOH、NaCl、HCl、計(jì)數(shù)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、革蘭氏染色試劑盒(北京陸橋)、1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺、1%a-萘酚-乙醇溶液、氧化發(fā)酵 O/F培養(yǎng)基、氧化三甲胺培養(yǎng)基(上海源葉)、美藍(lán)溶液、3%H2O2液等。

1.3 儀器和設(shè)備

雙面垂直超凈工作臺(tái)SW-CJ-2(上海綠宇);電熱鼓風(fēng)干燥箱BGZ-146(上海綠宇);高壓蒸汽滅菌鍋YXQ-SG46-280S(上海博訊);電熱恒溫培養(yǎng)箱HPX-9162MBE(上海博訊);電熱恒溫水浴鍋 HH.S11-2(上海博訊);生物顯微鏡XSP-2CA(上海光學(xué)儀器)。

1.4 分析和檢驗(yàn)方法

感官評(píng)分:參照曹榮“對(duì)蝦生物保鮮與其熟制品保藏技術(shù)的研究”中對(duì)蝦感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行［3］。

細(xì)菌總數(shù)測(cè)定(CFU/g):采用GB/T 4789.2－2010食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定的方法［4］。

平板劃線分離:參考張嫻等“活性污泥中細(xì)菌的分離、純化與培養(yǎng)”中平板劃線的方法進(jìn)行［5］。

生理生化鑒定:按照Bagge-Ravn等提出的海產(chǎn)魚(yú)貝類(lèi)細(xì)菌測(cè)定圖示［6］和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［7］以及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［8］進(jìn)行。

1.5 實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)

1.5.1 南美白對(duì)蝦冷藏過(guò)程中的細(xì)菌總數(shù)測(cè)定

采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定南美白對(duì)蝦冷藏過(guò)程中的細(xì)菌總數(shù)。對(duì)蝦經(jīng)去頭清洗后分組，在(4±1)℃條件下冷藏，然后每天從冰箱中取出對(duì)蝦樣品一組，按照曹榮［3］的方法進(jìn)行感官鑒定。取同組中的南美白對(duì)蝦適量，去殼，蝦肉勻漿后制成含菌樣液，然后按照黃秀梨等［9］主編的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)進(jìn)行10倍梯度稀釋。取適當(dāng)稀釋倍數(shù)的樣液1 mL，與10 mL的計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基混合，培養(yǎng)基需預(yù)先冷卻至50℃左右，使它既不凝固，又不會(huì)燙死樣液中的微生物。待混合有樣液的培養(yǎng)基凝固后于30℃倒置培養(yǎng)72 h，參照文獻(xiàn)［4］的方法計(jì)算細(xì)菌總數(shù)。

1.5.2 細(xì)菌的分離與鑒定

將菌落數(shù)為30～100個(gè)的計(jì)數(shù)平板上的細(xì)菌進(jìn)行純化分離，之后將這些細(xì)菌按個(gè)體形態(tài)、菌落特征和革蘭氏染色結(jié)果進(jìn)行分組，參照海產(chǎn)魚(yú)貝類(lèi)細(xì)菌測(cè)定圖示［6］以及文獻(xiàn)［7－8］中關(guān)于細(xì)菌鑒定的方法，將每一組中的細(xì)菌進(jìn)行相關(guān)的生理生化實(shí)驗(yàn)，如氧化酶實(shí)驗(yàn)、O/F發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、氧化三甲胺分解實(shí)驗(yàn)、H2O2酶實(shí)驗(yàn)等，初步鑒定到細(xì)菌的屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)蝦冷藏過(guò)程中細(xì)菌總數(shù)變化

將湛江地區(qū)養(yǎng)殖的南美白對(duì)蝦經(jīng)預(yù)處理后在(4±1)℃條件下進(jìn)行冷藏保鮮，每天取樣檢測(cè)其感官品質(zhì)和細(xì)菌總數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，湛江地區(qū)養(yǎng)殖的南美白對(duì)蝦的初始含菌量為2.8×104CFU/g，(4±1)℃條件下冷藏1d后，細(xì)菌總數(shù)減少為3.4×103CFU/g，這是因?yàn)槟厦腊讓?duì)蝦在溫暖的水體環(huán)境中感染的某些嗜溫菌在冷藏時(shí)生長(zhǎng)受到抑制，只有耐低溫的細(xì)菌才能大量繁殖;冷藏至第2天，細(xì)菌總數(shù)為5.1×104CFU/g，此時(shí)蝦肉品質(zhì)較好，處于 GB 2733－2005［10］規(guī)定的一級(jí)鮮度;第3天時(shí)，細(xì)菌數(shù)量增長(zhǎng)至4.5×105CFU/g，接近海蝦二級(jí)鮮度的上限;冷藏至4 d，細(xì)菌總數(shù)為3.0×106CFU/g，超過(guò)106CFU/g，到達(dá)貨架期終點(diǎn);冷藏5 d以后，細(xì)菌總數(shù)的增長(zhǎng)變得比較緩慢，可能是由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量消耗和腐敗菌大量繁殖，抑制了其他微生物生長(zhǎng)的緣故。冷藏至第6天，細(xì)菌總數(shù)高達(dá)2.4×107CFU/g，蝦肉完全腐敗變質(zhì)，不能食用。

圖1 對(duì)蝦冷藏過(guò)程中細(xì)菌總數(shù)和感官評(píng)分變化Fig.1 Changes in bacterial amount and sensory score of Penaeus vanmamei during refrigerated storage

感官評(píng)定的結(jié)果與細(xì)菌總數(shù)的變化基本一致，第4天的感官評(píng)分為9分，參照文獻(xiàn)［3］，此時(shí)感官上已不可接受，貨架期結(jié)束;第6天的感官評(píng)分僅為4分，對(duì)蝦肌肉已腐敗，氣味和色澤也不可接受。本實(shí)驗(yàn)條件下冷藏南美白對(duì)蝦的貨架期為4 d，這與曹榮等［11］的研究結(jié)果一致，而郭紅等［12］的研究表明，初始細(xì)菌總數(shù)不同，導(dǎo)致用更低的溫度保藏時(shí)其貨架期也為4 d，說(shuō)明初始含菌量是影響貨架期的最主要的因素。

2.2 細(xì)菌的分組與鑒定

湛江地區(qū)養(yǎng)殖的南美白對(duì)蝦在(4±1)℃條件下冷藏時(shí)分離得到的細(xì)菌按形態(tài)特征、革蘭氏染色后可分為10組，將每組中的細(xì)菌進(jìn)行生理生化鑒定，其結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可以看出，10組細(xì)菌形成的菌落大都是白色、圓形、粘稠、隆起、表面光滑、邊緣整齊且不透明的，但第Ⅴ組為黃色、第Ⅵ和第Ⅸ組為淺黃色菌落，Ⅶ、Ⅹ組菌落扁平、形狀不太規(guī)則且邊緣不完整，Ⅰ、Ⅵ組菌落半透明，Ⅰ、Ⅲ、Ⅶ組菌落表面干燥且Ⅰ、Ⅵ、Ⅸ組產(chǎn)生難聞的臭味;通過(guò)革蘭氏染色和鏡檢可知，第Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ組為 G－，Ⅱ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ組為G+，Ⅳ和Ⅷ組是球菌，其他為桿菌。由表1的菌落特征和生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合Bagge-Ravn等提出的海產(chǎn)魚(yú)貝類(lèi)細(xì)菌測(cè)定圖示［6］可以初步判定，第Ⅰ組為假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)、第Ⅱ組為乳酸菌屬(Lactic acid bacteria spp.)、第Ⅲ組為腸桿菌屬(Enterobacteriaceae spp.)、第Ⅳ組為葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.)、第Ⅴ組為黃桿菌屬(Flavobacterium spp.)、第Ⅵ組為希瓦氏菌屬(Shewanella spp.)、第Ⅶ組為棒桿菌屬(Corynebacterium spp.)、第Ⅷ組為微球菌屬(Micrococcus spp.)、第Ⅸ組為氣單胞菌屬(Aeromonas spp.)、第Ⅹ組為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter spp.)。

表1 細(xì)菌的形態(tài)特征及生理生化特性Table 1 The morphological characteristics and physiological-biochemical characteristic of bacteria

2.3 南美白對(duì)蝦冷藏過(guò)程中的菌相變化

將南美白對(duì)蝦經(jīng)去頭等預(yù)處理后在(4±1)℃條件下冷藏，分別對(duì)冷藏初期(第0天)、高品質(zhì)期(第2天)和貨架期終點(diǎn)(第4天)的細(xì)菌進(jìn)行分離和鑒定。由細(xì)菌的形態(tài)特征結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)分析得到南美白對(duì)蝦冷藏過(guò)程中的菌相變化，其結(jié)果如表2所示。

表2 南美白對(duì)蝦冷藏過(guò)程中的菌相變化Table 2 Bacterial flora change in Penaeus vanmamei during refrigerated storage

由表2可見(jiàn)，在南美白對(duì)蝦的冷藏過(guò)程中革蘭氏陰性菌占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，冷藏初期分離獲得的10個(gè)屬的細(xì)菌中，有6個(gè)屬為G－，其數(shù)量占細(xì)菌總數(shù)的80%，且以黃桿菌的數(shù)量最多，占細(xì)菌總數(shù)的33.3%，其次是氣單胞菌，百分含量為13.3%，不動(dòng)桿菌和假單胞菌占有10%的相同比例;冷藏至第2天，此時(shí)的對(duì)蝦為高品質(zhì)期，G－的數(shù)量增長(zhǎng)至86.7%，仍以黃桿菌(30%)的數(shù)量最多，不動(dòng)桿菌由10%增長(zhǎng)到16.7%，氣單胞菌和假單胞菌均占細(xì)菌總數(shù)的13.3%;隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌種類(lèi)逐漸減少，貨架期終點(diǎn)只分離到8個(gè)屬的細(xì)菌，其中G－占93.4%，氣單胞菌和假單胞菌均增加到16.7%，而黃桿菌減少為26.7%，其他種類(lèi)的G－均有不同程度的增長(zhǎng)。貨架期內(nèi)希瓦氏菌的數(shù)量增長(zhǎng)緩慢，僅由6.7%增加到10.0%，不動(dòng)桿菌和腸桿菌的數(shù)量較穩(wěn)定，均占細(xì)菌總數(shù)的10.0%左右，這與曹榮［11］及趙海鵬［13］等的研究結(jié)果存在差異，可能是養(yǎng)殖環(huán)境不同導(dǎo)致的初始細(xì)菌組成不同所致。

2.4 南美白對(duì)蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌的初步鑒定

當(dāng)南美白對(duì)蝦冷藏至第6天時(shí)，蝦肉腐敗變質(zhì)不可食用，在此狀態(tài)下我們共分離得到87株細(xì)菌，按細(xì)菌形態(tài)特征結(jié)合文獻(xiàn)［6］進(jìn)行分類(lèi)鑒定后發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌有4個(gè)屬，其各自所占的比例見(jiàn)表3。

表3 南美白對(duì)蝦冷藏時(shí)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的組成Table 3 The composition of dominated spoilage organisms in Penaeus vannammei

從表3可知，4個(gè)屬的優(yōu)勢(shì)腐敗菌均為革蘭氏陰性菌，它們占細(xì)菌總數(shù)的93.11%，分別是黃桿菌(28.74%)、氣單胞菌(16.09%)、假單胞菌(21.84%)和希瓦氏菌(26.44%)。南美白對(duì)蝦冷藏時(shí)腐敗變質(zhì)主要是由這4個(gè)屬細(xì)菌的分解代謝造成的，黃桿菌對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的水解能力，它使蝦肉在短時(shí)間內(nèi)失去食用價(jià)值。氣單胞菌與其他腐敗菌協(xié)同作用，也能水解蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪等，并且產(chǎn)生的尸胺是腐敗時(shí)不良?xì)馕兜闹苯觼?lái)源［14］。同時(shí)，氣單胞菌和希瓦氏菌能分解氧化三甲胺(TMAO)生成三甲胺(TMA)，使對(duì)蝦逐漸失去鮮味而變?yōu)殡y聞的臭魚(yú)腥味。假單胞菌和希瓦氏菌的代謝作用能使蝦肉發(fā)粘、變色，并產(chǎn)生氨和H2S等而散發(fā)出刺鼻的臭味［15］，使蝦肉在感官上難以接受。從腐敗的南美白對(duì)蝦蝦肉中分離獲得的優(yōu)勢(shì)菌中，假單胞菌和希瓦氏菌所占比例較高，這與Gill等［16］的研究結(jié)果相似，認(rèn)為假單胞菌和希瓦氏菌的存在是冷鏈流通中高蛋白水產(chǎn)品腐敗的主要原因。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

(1)湛江地區(qū)養(yǎng)殖的南美白對(duì)蝦在4±1℃的冷藏過(guò)程中，G－的數(shù)量由80.0%增長(zhǎng)到93.4%，冷藏初期以黃桿菌和氣單胞菌數(shù)量最多，其次是不動(dòng)桿菌和假單胞菌;高品質(zhì)期黃桿菌和不動(dòng)桿菌占優(yōu)勢(shì)，其次是氣單胞菌和假單胞菌;貨架期結(jié)束時(shí)，黃桿菌、氣單胞菌和假單胞菌所占比例較大。

(2)南美白對(duì)蝦在(4±1)℃條件下冷藏至第6天，細(xì)菌總數(shù)高達(dá)2.4×107CFU/g，感官評(píng)分僅為4分，蝦肉完全腐敗變質(zhì)，不能食用。此時(shí)從蝦肉中分離得到4個(gè)屬的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，它們均為革蘭氏陰性菌，分別是黃桿菌、希瓦氏菌、假單胞菌和氣單胞菌，共占細(xì)菌總數(shù)的93.11%，它們是導(dǎo)致南美白對(duì)蝦冷藏時(shí)腐敗的根本原因。

3.2 討論

本研究分析的對(duì)蝦的細(xì)菌菌相反映了湛江東海養(yǎng)殖環(huán)境下的南美白對(duì)蝦的細(xì)菌組成，當(dāng)然，細(xì)菌的種類(lèi)和數(shù)量還受到季節(jié)、捕撈方式等因素的影響［17］。目前，關(guān)于魚(yú)、蝦的菌相分析的研究并不少見(jiàn)［18］，但是有關(guān)湛江地區(qū)的養(yǎng)殖蝦的細(xì)菌組成的研究還甚少。雖然不同地區(qū)的南美白對(duì)蝦初始含菌量相差并不明顯，但是其細(xì)菌組成卻有較大的差異，導(dǎo)致保藏過(guò)程中呈優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)并對(duì)腐敗起主要作用的細(xì)菌的組成也有所不同。

以食品保藏為目的的細(xì)菌鑒定到屬就已經(jīng)足夠了，目前，關(guān)于細(xì)菌鑒定的方法有多種，并且日益精確、方便和快捷，傳統(tǒng)的通過(guò)細(xì)胞形態(tài)和習(xí)性的觀察只能對(duì)細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，以肽聚糖為基礎(chǔ)的細(xì)胞化學(xué)成分的分析、以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)水平的鑒定和以核酸為基礎(chǔ)的核酸水平的鑒定都使細(xì)菌分類(lèi)更加快速、準(zhǔn)確。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于特定腐敗菌的研究已比較深入，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為耐冷的假單胞菌和希瓦氏菌是對(duì)蝦冷藏過(guò)程中的特定腐敗菌，本研究發(fā)現(xiàn)，湛江的養(yǎng)殖環(huán)境使南美白對(duì)蝦的優(yōu)勢(shì)腐敗菌變?yōu)辄S桿菌和希瓦氏菌，其次是假單胞菌和氣單胞菌，它們占了細(xì)菌總數(shù)的90%以上，是腐敗的直接原因。

對(duì)對(duì)蝦冷藏時(shí)的細(xì)菌菌相和優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行分析，可以為靶向抑菌的保鮮方法的開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)支持，還可以為優(yōu)勢(shì)腐敗菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的構(gòu)建和產(chǎn)品鮮度以及貨架期的預(yù)測(cè)提供理論依據(jù)。

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