杜仲葉醋發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化

賈春鳳 劉 愷 陳梅香

JIA Chun-feng LIU KaiCHEN Mei-xiang

（保定學(xué)院，河北 保定 071000）

(Baoding College,Daoding,Hebei071051,China)

當(dāng)今，大量資料[1-5]顯示：醋已從單純的調(diào)味品逐漸成為藥療與食療俱佳的著名食品之一。目前保健醋的種類繁多。有棗醋[1]、蘋果果醋[2]、柿子醋飲[3]、岐山香醋[4]、楊梅果醋[5]、木瓜果醋[6]、胡柚果醋[7]等等。這些醋產(chǎn)品都是根據(jù)不同的原料來命名的，并根據(jù)其特性進(jìn)行了工藝研究。特定的工藝針對特定的原料有利于保持原物料的特性及營養(yǎng)價(jià)值，從而更好地達(dá)到保健目的。

杜仲(eucommia ulmoides oliver)為杜仲科(eucommiace-ae)植物，是具有悠久使用歷史的名貴藥材，一般以皮入藥。研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉中含有的化學(xué)成分和杜仲皮中的極為相似、且二者具有相近藥理作用[8,9]，杜仲葉綠原酸含量為1.27%～4.06%[10]，杜仲葉中綠原酸含量相當(dāng)豐富，因此，《中華人民共和國藥典》2005年將綠原酸定為評價(jià)杜仲葉質(zhì)量優(yōu)劣的主要技術(shù)指標(biāo)[11]。中國杜仲資源豐富，但杜仲葉利用率較低，僅10%～20%[12]。

本試驗(yàn)主要對以杜仲葉為主要原料的杜仲葉醋發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，可以充分利用中國杜仲葉資源。本試驗(yàn)除了以傳統(tǒng)的糖、乙酸含量為發(fā)酵工藝測定目標(biāo)外，還增添了綠原酸含量的檢測，更突出了杜仲葉醋的保健功能，同時(shí)為杜仲葉醋工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲葉：陜西省漢中市略陽縣秋季老葉；

醋前發(fā)酵劑：上海佳民釀造食品有限公司；

纖維素酶：1×104U/g，北京奧博星公司；

95%的乙醇、乙腈、冰乙酸、氫氧化鈉：分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：AB104-N型，上海第二天平儀器廠；

高效液相色譜儀，LC-20AT型，日本島津公司；

手持式糖量折光儀：WAY-32型，上海光學(xué)五廠；

分析天平：PL403型，梅特勒—托力多儀器(上海)有限公司；

恒溫水浴鍋：DSY-2-8型，北京國華醫(yī)療器械廠；

往復(fù)式水浴恒溫振蕩器：SHZ-88型，江蘇太倉市試驗(yàn)設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 杜仲葉醋發(fā)酵工藝流程

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別對不同的麩皮添加量、料液比、滅菌時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以糖含量為指標(biāo)，選擇正交試驗(yàn)的因素水平。

1.3.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用 L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以糖含量和綠原酸含量為指標(biāo)優(yōu)化乙醇發(fā)酵前工藝條件。

1.3.4 乙醇發(fā)酵時(shí)間、乙酸發(fā)酵時(shí)間、葡萄糖添加量對杜仲葉醋發(fā)酵的影響 在1.3.3最優(yōu)試驗(yàn)條件下，測定乙醇發(fā)酵最佳時(shí)間、乙酸發(fā)酵最佳時(shí)間，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵結(jié)果—乙酸含量低于國家標(biāo)準(zhǔn)，添加不同含量的葡萄糖，考察葡萄糖添加量對發(fā)酵結(jié)果—乙酸和綠原酸含量的影響。

1.3.5 杜仲葉醋品質(zhì)評價(jià) 參照GB 18187——2000，對成品的感官指標(biāo)、理化指標(biāo)和衛(wèi)生指標(biāo)進(jìn)行分析。

1.3.6 乙酸菌AS.14l懸液制備 參照文獻(xiàn)[13]。

1.3.7 綠原酸和乙酸測定方法

(1)綠原酸含量測定：高效液相色譜法測。迪馬C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），以乙腈∶水∶冰乙酸(12∶88∶1)為流動(dòng)相，檢測波長325 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量5μL。將稀釋后的樣品測得峰面積代入已測方程：y=16 362x-137 670，R2=0.996 7，求得含量綠原酸。

(2)乙酸含量的測定：酸堿中和滴定法。具體操作：吸取0.1mL試樣置于試管中，加入3.9mL蒸餾水，充分震蕩混勻，用氫氧化鈉溶液（c(NaOH)=0.0050 mol/L或c(NaOH)=0.050mol/L）滴定至酚酞變色為滴定終點(diǎn)，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)，可計(jì)算總酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0進(jìn)行了處理和分析，最后取用平均值表示。用Sigmaplot 10.0作圖，試驗(yàn)最終結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解液中綠原酸含量的測定

根據(jù)方法1.3.1，測定本次酶解液中綠原酸的含量為(1.26±0.11)mg/mL。

2.2 乙醇發(fā)酵前工藝參數(shù)的選擇試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 麩皮添加量的影響 在10 mL杜仲葉酶解液中加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的麩皮：0.5，1.0，1.5，2.0 g。121 ℃滅菌 30 min后冷卻，不加糖，未進(jìn)行發(fā)酵，直接測定糖含量。由圖1可知，隨著麩皮添加量的增大，糖的含量呈現(xiàn)上升趨勢，在添加2.0 g麩皮時(shí)，經(jīng)滅菌后樣品中液體存在量很少，添加量為0～1.0 g/10mL時(shí)，糖含量增加較快，添加量為1.5～2.0 g/10mL時(shí)，糖含量增加較慢，因此確定1.5 g/10mL麩皮添加量為本試驗(yàn)最佳試驗(yàn)參數(shù)。

圖1 麩皮添加量對糖含量的影響Figure1 Effectofbran addition on the contentofsugar

2.2.2 水添加量的影響 10 mL酶解液中添加1 g麩皮，0，5，10，20mL 蒸餾水，121 ℃滅菌 30min后冷卻，不加糖，未進(jìn)行發(fā)酵，直接測定糖含量。由圖2可知，水的添加量對糖含量的影響相當(dāng)大。隨著水添加量的增加，糖含量呈顯著下降趨勢，因此水的添加量為0mL時(shí)，只添加10mL杜仲酶解液時(shí)，糖含量最高。

圖2 水的添加量對糖含量的影響Figure2 Effectofwateraddition on the contentofsugar

2.2.3 滅菌時(shí)間的影響 10mL酶解液中添加1.5 g麩皮，在121 ℃下滅菌時(shí)間分別設(shè)為 15，20，30，40min，放涼，不加糖，未進(jìn)行發(fā)酵，直接測定糖含量。由圖3可知，糖含量隨著加熱時(shí)間的延長少有增加，尤其是加熱40min比加熱30min的樣品中糖的含量只增加了0.2%。因此，取20，30，40min作為下一步試驗(yàn)研究對象。

2.2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)的正交試驗(yàn)因素及水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

由表2可知，料液比對糖含量影響最大，接著是麩皮的添加量，最后是滅菌時(shí)間。由于當(dāng)麩皮添加量為2 g時(shí)，樣品中的液體含量已經(jīng)很少，因此在本試驗(yàn)中以糖含量為測定目標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果顯示乙醇發(fā)酵前最佳工藝：麩皮添加量為2 g，只添加10mL杜仲葉酶解液，滅菌時(shí)間為40min。結(jié)合單因素?cái)?shù)據(jù)進(jìn)一步分析可知滅菌30min時(shí)，糖的含量只比40min時(shí)少0.2%，本著在對糖含量影響不大，節(jié)約能源的原則，最佳滅菌時(shí)間定為30min。此時(shí)，綠原酸含量為 (0.6±0.022)mg/mL：

圖3 滅菌時(shí)間對糖含量的影響Figure3 Effectofhated time on the contentofsugar

表1 正交試驗(yàn)因素及水平Table1 Factorsand levelsoforthogonal tests

在此最優(yōu)工藝參數(shù)下，根據(jù)1.3.1工藝進(jìn)行發(fā)酵，乙醇發(fā)酵在第4天，糖含量基本不變；乙酸發(fā)酵到第5天，乙酸含量開始下降，但第4天最高含量的乙酸小于1 g/100 mL，因此乙醇發(fā)酵前需要補(bǔ)糖。

2.3 乙醇發(fā)酵時(shí)間和乙酸發(fā)酵時(shí)間的確定及葡萄糖的添加量對乙酸發(fā)酵的影響

由表3可知，乙醇發(fā)酵到第3天時(shí)，各樣品中糖含量幾乎降到最低，因此乙醇發(fā)酵最佳時(shí)間為3 d。不添加葡萄糖時(shí)，樣品發(fā)酵到在第4天時(shí)乙酸含量達(dá)到最高，第5天開始下降；添加了2%和4%葡萄糖的發(fā)酵樣在乙酸發(fā)酵的第3天和第4天分別出現(xiàn)最高乙酸含量，雖然還是較低，但已達(dá)到GB 18187——2000中規(guī)定值（總酸≥3.5 g/100mL，以乙酸計(jì)）；和其他樣品比較，添加6%葡萄糖樣品在第4天時(shí)乙酸含量最高，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于GB 18187——2000中規(guī)定值；并且，乙酸發(fā)酵到第4天時(shí)，各樣品中綠原酸含量變化幅度較小；因此乙酸最佳發(fā)酵時(shí)間為4 d，葡萄糖最佳添加量為6 g/100mL。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Orthogonalarray design and results

表3 糖的添加量對杜仲葉醋乙酸的影響Table3 Effectofglucoseaddition on eucommiaulmoidesvinegar

由試驗(yàn)結(jié)果可知，糖添加量能夠促使乙醇生成，有利于乙酸發(fā)酵；但隨著葡萄糖添加量的增加，其乙酸含量最高值出現(xiàn)時(shí)間逐漸延長，可能是高糖產(chǎn)生的高乙醇含量抑制了乙酸菌代謝形成乙酸，使之代謝減緩造成的[14]。綠原酸的含量卻隨著糖的添加量的增加而略有增加，這可能是綠原酸易溶于乙醇和乙酸的性質(zhì)造成的，但整體變化不大。發(fā)酵到第4天時(shí)，添加6%葡萄糖樣品綠原酸的含量為0.61mg/mL。研究[15]表明，當(dāng)綠原酸溶液綠中原酸含量為大于等于0.1mg/mL時(shí)對過氧化氫的最大清除率可達(dá)95.43%；對氧自由基和羥自由基清除效果較好較穩(wěn)定，對脂質(zhì)過氧化也有明顯的抑制作用。因此本最優(yōu)工藝下的杜仲葉醋有較好的抗氧化功能。

2.4 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)

2.4.1 感官指標(biāo) 色澤：紅棕色，透亮；香氣：醋香味和杜仲葉特有的藥香味；滋味：醋味鮮，略有淡淡的杜仲葉藥味；體態(tài)：純凈，無懸浮物，無雜質(zhì)。符合GB 18187——2000規(guī)定。

2.4.2 理化指標(biāo) 總酸(以乙酸計(jì))為(4.46±0.05)g/100mL，綠原酸含量為(0.60±0.06)mg/mL，游離礦酸、總砷、鉛、黃曲霉毒素符合GB 18187——2000規(guī)定。

2.4.3 衛(wèi)生指標(biāo) 菌落總數(shù)≤100 CFU/mL，大腸菌群未檢出，致病菌未檢出，符合GB 18187——2000規(guī)定。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以資源豐富的杜仲葉為主要原料，進(jìn)行酶解；采用L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別考察了水添加量、麩皮添加量及滅菌時(shí)間對糖和綠原酸的影響；并考察乙醇發(fā)酵時(shí)間、乙酸發(fā)酵時(shí)間和葡萄糖添加量對乙酸和綠原酸含量的影響，確定最佳工藝為原料配比是麩皮質(zhì)量∶葡萄糖質(zhì)量∶杜仲葉酶解液體積為2∶0.6∶10，121℃滅菌30min；乙醇發(fā)酵最適時(shí)間為3 d；乙酸發(fā)酵最適時(shí)間為4 d，最終可得總酸(以乙酸計(jì))為(4.46±0.05)g/100 mL、綠原酸含量為(0.60±0.06)mg/mL 的優(yōu)質(zhì)杜仲葉發(fā)酵醋。

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