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    黏質(zhì)紅酵母的鑒定及鏈格孢菌抑菌機(jī)制的研究

    2013-05-10 12:18:12蔡文韜夏延斌易有金任佐華
    食品與機(jī)械 2013年2期
    關(guān)鍵詞:鏈格提液孢菌

    蔡文韜 夏延斌 夏 菠 易有金 任佐華

    CAIWen-tao XIA Yan-bin XIA Bo YIYou-jin REN Zuo-hua

    (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),湖南 長(zhǎng)沙 410128)

    (Hunan Agricultrue University,Changsha,Hunan 410128,China)

    鏈格孢菌是茄科植株中危害較大的病害之一。該病不僅發(fā)生在田間,更是采后貯藏過(guò)程中的重要性病害,可侵染番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯等茄科類(lèi)果蔬[1,2],侵害途徑主要是通過(guò)氣孔、皮孔、傷口或表皮侵入果實(shí),在適宜條件下產(chǎn)生大量孢子,對(duì)果實(shí)造成嚴(yán)重危害[3]。目前主要采用化學(xué)法進(jìn)行防治,但是長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥不僅會(huì)造成環(huán)境污染,也會(huì)使得病原菌的抗藥性增強(qiáng)[4],果蔬上殘留的農(nóng)藥也會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生危害[5,6]。因此,利用生物法進(jìn)行果蔬采后病害防控,得到越來(lái)越多的關(guān)注。

    植物內(nèi)生菌是一類(lèi)適宜在植物體內(nèi)生長(zhǎng)的微生物,一般具有較高的安全性,其中部分菌株具有潛在的抗病菌的能力[7]。近年來(lái),利用植物內(nèi)生細(xì)菌防治植物土傳病的研究已取得較大進(jìn)展。但是對(duì)利用微生物進(jìn)行果蔬采后保鮮方面的研究甚少,且多數(shù)集中在細(xì)菌如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等生物防治方面,并取得了較好的成果。劉杰鳳等[8]從番茄、辣椒、茄子中分離出14株對(duì)青枯病有較強(qiáng)抑制作用的內(nèi)生細(xì)菌;何紅[9],邱思鑫[10]等報(bào)道了內(nèi)生芽孢桿菌(Bacillus sp.)對(duì)辣椒疫霉引起的辣椒苗和果疫病有良好的防治效果;阿里馬斯等[11]報(bào)道了放線菌對(duì)辣椒疫霉菌和炭疽病防治效果,但是關(guān)于內(nèi)生真菌用于茄科鏈格孢菌的生防研究未見(jiàn)報(bào)道。另外由于這些微生物主要源于土壤、果蔬表面,易受外界因素的影響,導(dǎo)致防治效果不穩(wěn)定,極大地影響了拮抗菌的實(shí)用價(jià)值。因此植物內(nèi)生菌的活性物質(zhì)的提取及其環(huán)境穩(wěn)定性的研究在生物防治和果蔬采后處理已成為研究的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)從湖南省長(zhǎng)沙縣果蔬中心采集的柿子椒中篩選到了鏈格孢菌的拮抗真菌,通過(guò)16SrDNA序列分析對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定,為黏質(zhì)酵母菌。用乙酸乙酯和無(wú)水乙醇對(duì)黏質(zhì)酵母菌發(fā)酵液抗菌物質(zhì)進(jìn)行提取,并進(jìn)行活性穩(wěn)定性測(cè)試和防腐應(yīng)用研究,以期為食品防腐尋求新的技術(shù)途徑,使內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物成為果蔬采后微生物抑制劑和作為天然殺菌劑具有廣泛應(yīng)用前景和開(kāi)發(fā)潛能。

    1 材料與方法

    1.1 供試菌株

    Strain-39菌:由本實(shí)驗(yàn)室從柿子椒果肉中分離得到;

    鏈格孢菌:由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)中心提供。

    1.2 Strain-39分子鑒定

    參照文獻(xiàn)[12]、[13]進(jìn)行16SrDNA分子鑒定,PCR產(chǎn)物直接測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。得到的序列運(yùn)用Clust X軟件校準(zhǔn)排齊后,在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)同源性比對(duì)分析。以16SrDNA的序列同源性大于99%為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行屬種歸類(lèi)。然后在對(duì)待測(cè)菌株與模式菌株16SrDNA序列利用程序MEGA3.1中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),進(jìn)一步進(jìn)行種屬鑒定[14]。

    1.3 拮抗菌strain-39的抑病活性檢測(cè)

    辣椒和番茄用自來(lái)水反復(fù)清洗干凈,用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡消毒1~2min,然后用自來(lái)水沖洗掉殘余次氯酸鈉,晾干。用滅過(guò)菌的打孔器在番茄和辣椒各部位打一個(gè)直徑6mm深2 mm的洞,接種拮抗菌strain-39約106CFU/mL的培養(yǎng)濾液20μL,靜止5 min后,接種病原菌鏈格孢菌約106CFU/mL的菌液20μL,以不接種病原菌和接種病原菌的未浸泡拮抗菌的辣椒和番茄作為對(duì)照,28℃培養(yǎng)72 h,觀察果蔬是否出現(xiàn)病斑及感病的程度。

    1.4 Strain-39菌液成分對(duì)鏈格孢菌抑菌測(cè)定方法

    在PDA平板中心接直徑為5mm的鏈格孢菌菌餅,28℃培養(yǎng)3 d后,在離菌落邊緣2.5 cm處用口徑9mm的打孔器打4個(gè)孔,每孔分別加入200μL經(jīng)過(guò)處理菌液成分,以無(wú)菌水作為空白對(duì)照,待對(duì)照病原菌菌落長(zhǎng)到孔邊緣(6~7 d)后測(cè)量抑菌圈直徑。

    (1)抑制率的計(jì)算:

    (2)Strain-39菌液濾液制備的方法:將strain-39接種于PDA液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)過(guò)夜作為種子液,按1%接種量接種于液體培養(yǎng)基中(裝液量100 mL/250 mL錐形瓶中),28℃,180 r/min培養(yǎng) 7 d,用 10 000 r/min離心 15 min,紗布雙層過(guò)濾去菌絲,用0.22μm的過(guò)濾頭過(guò)濾得到發(fā)酵液。

    (3)乙酸乙酯提取物的制備:發(fā)酵液用乙酸乙酯(1倍體積)萃取3次,重復(fù)3次,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮置干,用磷酸緩沖液溶解得乙酸乙酯提取液。

    (4)75%乙醇沉淀物的提?。簩o(wú)水乙醇置于冰箱內(nèi)進(jìn)行預(yù)冷處理,在抑菌物質(zhì)粗提液中緩慢加入乙醇使其在終濃度達(dá)到75%,于4℃靜置4 h以上,10 000 r/min,4℃離心20min,收集沉淀,即為粗提物,將所得蛋白溶于pH值為6.8的20mmol/L tris緩沖液中,所得沉淀即為75%乙醇沉淀粗提液。

    1.5 菌液成分的抑菌機(jī)制

    1.5.1 不同濃度菌液成分對(duì)鏈格孢菌抑菌效果 將strain-39菌液的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物按照半稀釋 法 配 成 一 系 列 質(zhì) 量 濃 度 梯 度(100,50,25,12.5,6.25mg/mL)的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物,75%乙醇沉淀粗提液用pH為6.8的20mmol/L tris緩沖液稀釋?zhuān)宜嵋阴ヌ崛∥镉昧姿峋彌_液稀釋?zhuān)赑DA平板中心接直徑為5mm的鏈格孢菌餅,25℃培養(yǎng)2~3 d后,在離菌落邊緣2.5 cm處用口徑9mm的打孔器打4個(gè)孔,每孔加200μL菌液成分,以無(wú)菌水作為空白對(duì)照,待對(duì)照快要長(zhǎng)滿全皿時(shí),測(cè)量抑菌直徑,3次重復(fù),計(jì)算毒理回歸方程、EC50值和95%置信區(qū)。

    1.5.2 Strain-39菌液成分對(duì)果實(shí)病害的抑菌作用 菌液乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物分別用緩沖液稀釋到100mg/mL待用選取外觀整齊、飽滿圓潤(rùn)、無(wú)損傷的新鮮辣椒和番茄,用自來(lái)水清洗后在0.1%次氯酸鈉溶液中浸泡消毒3min,再用自來(lái)水反復(fù)沖洗至殘余次氯酸鈉洗掉,晾干。用無(wú)菌的打孔器在番茄和辣椒的部位各打一個(gè)直徑6 mm深2mm的洞,注入20μL菌液成分,靜置2 h后,立即在傷口處加入20μL鏈格孢菌孢子懸浮液,以保鮮液和無(wú)菌水作為對(duì)照。用保鮮袋密封,以保持濕度,將蔬菜置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)貯藏,7 d后計(jì)算爛果率,每個(gè)處理分3組。每組隨機(jī)挑選60個(gè)果實(shí),試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。

    1.5.3 Strain-39菌液75%乙醇沉淀粗提液以及乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌菌絲形態(tài)影響 鏈格孢菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h活化,移接菌蝶5片于濃度為10%的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液中,以加相同量的不含菌的培養(yǎng)基為空白對(duì)照,培養(yǎng)48 h后在光學(xué)顯微鏡觀察病原菌菌絲形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化。

    1.5.4 75%乙醇沉淀粗提液及乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌分生孢子萌發(fā)的影響 將鏈格孢菌接種在PDA培養(yǎng)基上,于28℃培養(yǎng)10 d,然后加入一定量的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液沖洗斜面上的孢子,經(jīng)無(wú)菌紗布過(guò)濾除去菌絲殘?bào)w,用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液稀釋至孢子濃度為106個(gè)/mL。每個(gè)視野60個(gè)孢子(10倍放大),取20μL滴加在凹玻片上,將凹玻片放在滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi),培養(yǎng)皿內(nèi)預(yù)先放入10 mL無(wú)菌水,在無(wú)菌水上平放一張滅菌濾紙。再滴加20μL 75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液?;靹蚝笾糜?8℃下培養(yǎng)12 h,以無(wú)菌水處理為對(duì)照,并按式(2)計(jì)算拮抗菌的抑制率,每處理3次重復(fù),結(jié)果取平均值。

    1.5.5 胞外蛋白以及乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌分生孢子產(chǎn)生的影響 鏈格孢菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h,然后將菌蝶接種于PDA培養(yǎng)基中央,待菌落直徑達(dá)3 cm時(shí),將周?chē)囵B(yǎng)基挖出,將75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物分別用磷酸緩沖液稀釋2倍和10倍,分別取20mL淹沒(méi)真菌菌落20min,傾去緩沖稀釋液,每處理3次重復(fù),以無(wú)菌水處理為空白對(duì)照,置于28℃下培養(yǎng)6 d,至孢子產(chǎn)生,每平板用10mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液將孢子洗下,經(jīng)4層紗布過(guò)濾,得孢子懸浮液,用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

    1.5.6 不同溫度處理對(duì)75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響 將75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液2mL裝于試管中,在50,75,100℃條件下處理20min(恒溫水浴鍋內(nèi)進(jìn)行),121℃(高壓滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行)處理20min,以未進(jìn)行溫度處理的各樣品作為對(duì)照,測(cè)定抑菌活性,每處理3個(gè)重復(fù),試驗(yàn)結(jié)果取平均值。

    1.5.7 pH對(duì)75%乙醇沉淀提取液和乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響 調(diào)節(jié)50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)的pH值分別為 2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,將 75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物與不同的緩沖液等體積混合,置于4℃的冰箱內(nèi)保存24 h,再用2 mol/L的鹽酸、氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至原菌液成分酸堿度(7.0左右),用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。以鏈格孢菌為指示菌,測(cè)定抑菌活性,未經(jīng)過(guò)處理的各樣品作為對(duì)照,每處理3個(gè)重復(fù),試驗(yàn)結(jié)果取平均值。

    1.5.8 紫外線處理對(duì)75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響 取1 mL 75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液置于60W紫外燈下30 cm照射1 h,以未經(jīng)處理的各樣品成分為對(duì)照,每處理3個(gè)重復(fù),試驗(yàn)結(jié)果取平均值。

    1.5.9 數(shù)據(jù)分析 用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析,以P<0.05判斷差異有顯著性,P<0.01判斷差異極顯著,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌體和菌落特征

    圖1 菌株strain-39的16SrDNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 PCR results of 16SrDNA sequences from the isolated srains-39

    圖2 基于16SrDNA序列的菌株strain-39系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 2 Phylogenetic tree based on 16SrDNA sequence analysis of strain-39

    通過(guò)稀釋洗液涂布平板后可以形成單獨(dú)的菌落,這些內(nèi)生拮抗真菌的菌落形態(tài)相似,邊緣整齊,不著色,表面光滑,稍濕潤(rùn),無(wú)光澤,菌體橢圓形,橘紅色,取其中一個(gè)菌落,復(fù)紅簡(jiǎn)單染色后,置普通光學(xué)顯微鏡下觀察,菌體為革蘭氏陽(yáng)性。提取菌株strain-39基因組DNA,以?xún)?nèi)生菌株strain-39基因組DNA為模板,按1.2中的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1),對(duì)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序得到strain-39的16SrDNA長(zhǎng)度為539 bp。利用Blast軟件,將菌株的16SrDNA序列與GenBank中數(shù)據(jù)庫(kù)已知的16SrDNA基因序列進(jìn)行比對(duì),真菌strain-39的 16SrDNA 序列(539 bp)與(Uncultured basidiomycota genomic DNA)的序列相同。用軟件MEGA3.1按Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)相似性都達(dá)到100%,結(jié)合strain-39形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化指標(biāo)測(cè)定等表型鑒定結(jié)果,strain-39菌株鑒定為黏質(zhì)紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)。

    2.2 拮抗菌strain-39的抑病活性檢測(cè)

    由圖3可知,僅接種鏈格孢菌,不接種內(nèi)生菌的辣椒和番茄上出現(xiàn)明顯的鏈格孢菌病斑,而接種內(nèi)生菌的辣椒和番茄上,鏈格孢菌產(chǎn)生的病斑較小。說(shuō)明菌株stain-39發(fā)酵液能夠較好的降低鏈格孢菌的致病力。

    圖3 黏質(zhì)紅酵母strain-39對(duì)鏈格孢菌的抑菌活性試驗(yàn)Figure 3 Detection of inhibitory activity of strain-39 against pathogen A.alternate

    2.3 菌液75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌體外抑菌效果

    對(duì)菌株strain-39 75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液進(jìn)行抑菌活性測(cè)定,由圖4和表1可知,75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物稀釋不同濃度處理對(duì)鏈格孢菌都有較好的抑菌效果,strain-39菌液乙醇沉淀粗提液質(zhì)量濃度梯度為 100,50,25,12.5,6.25mg/mL 時(shí)對(duì)鏈格孢菌的抑制率分別為85.45%,80%,54.55%,43.64%,28.88%。乙酸乙酯提取物質(zhì)量濃度梯度為 100,50,25,12.5,6.25mg/mL 時(shí)對(duì)鏈格孢菌抑制率分別為 86.85%,81.97%,72.13%,45.90%,35.87%,其中75%乙醇沉淀提取液的EC50為16.353 1 mg/L,而乙酸乙酯提取物的EC50為11.800 3mg/L,后者抑菌效果較前者高。

    2.4 Strain-39菌液成分對(duì)果實(shí)病害的抑菌作用

    由圖5可知,通過(guò)損傷接種,strain-39的菌液成分對(duì)茄科植物辣椒和番茄果肉都具有明顯的抑菌作用,在一定質(zhì)量濃度下均能降低辣椒和番茄的爛果率,乙酸乙酯提取物質(zhì)量濃度為100 mg/mL時(shí),辣椒的爛果率與無(wú)菌水相比下降了51.879%,番茄的爛果率與無(wú)菌水相比下降了58.47%,75%乙醇沉淀粗提液的腐爛率與無(wú)菌水相比辣椒的爛果率下降了47.5%,番茄的爛果率與無(wú)菌水相比下降了50.47%,不同菌液成分相比,乙酸乙酯提取物比75%乙醇沉淀粗提液的抑菌效果較好,與體外抑菌效果一致。與體外抑制作用效果相比,體內(nèi)抑制作用的效果顯然有所降低,但直接證明了strain-39抑菌成分對(duì)果實(shí)病害的抑制作用。

    2.5 Strain-39菌液75%乙醇沉淀粗提液以及乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌菌絲形態(tài)的影響

    圖4 75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌抑菌效果Figure 4 Effecton A.alternata by 75%ethanol sediment liquid and ethyl acetate extract produced from strain-39

    表1 菌株strain-39不同菌液成分對(duì)鏈格孢菌的抑制作用Table1 Inhibition effects of extraction from strain-39 against A.alternate

    由圖6和7可知,strain-39菌液75%乙醇沉淀粗提液及乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢病菌菌絲的形態(tài)均有影響,將鏈格孢菌與strain-39 75%乙醇沉淀提取液和乙酸乙酯提取物在PDA平板上對(duì)峙培養(yǎng)6 d后,產(chǎn)生明顯的抑菌帶,靠近菌液成分邊緣處的病菌不能正常向外擴(kuò)展,而且此處菌絲變成褐色,說(shuō)明其活性物質(zhì)可抑制鏈格孢菌的生長(zhǎng),調(diào)取邊緣菌絲在顯微鏡下觀察,活性成分邊緣的鏈格孢菌的菌絲頂端及中間形成大量泡狀體,以致整個(gè)菌絲變成串珠狀,菌絲體分枝增多、畸形。且乙酸乙酯提取物處理的部分菌絲呈現(xiàn)原生質(zhì)顆?;?,而正常生長(zhǎng)的菌絲成細(xì)長(zhǎng)狀,且整個(gè)菌絲均勻透明。

    2.6 Strain-39 75%乙醇沉淀粗提液及乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌分生孢子萌發(fā)的影響

    由表2可知,strain-39的75%乙醇沉淀粗提液處理后抑制鏈格孢菌分生孢子的萌發(fā)率為7.45%,而以無(wú)菌水處理的對(duì)照處理組分生孢子萌發(fā)率為75.36%;乙酸乙酯提取物處理過(guò)的孢子萌發(fā)率為9.6%,對(duì)照組為73.65%。由此說(shuō)明,strain-39的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌分生孢子的萌發(fā)都具有較好抑制作用。

    圖5 Strain-39菌液成分對(duì)辣椒、番茄的抑制效果的影響Figure 5 Inhibitory effectof extraction from strain-39 on diseases of peppers and tomatoes

    圖6 Strain-39 75%乙醇沉淀提取液處理鏈格孢菌菌絲的形態(tài)Figure 6 Effectonmorphology by 75%ethanol sediment liquid produced from strain-39

    圖7 Strain-39乙酸乙酯提取物處理鏈格孢菌菌絲的形態(tài)Figure 7 Effectonmorphology by ethyl acetate extract produced from strain-39

    表2 Strain-39的75%乙醇沉淀粗提物和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌分生孢子萌發(fā)的影響Table2 Effecton germination of conidiospore of A.alternata by 75%ethanol sedimentand ethyl acetate extract produced from strain-39

    2.7 Strain-39的75%乙醇沉淀粗提液以及乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌分生孢子產(chǎn)生的影響

    將PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至3 cm的鏈格孢菌菌塊分別加入稀釋2倍、10倍濃度的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液20mL,浸沒(méi)菌落20min后去除液體,以無(wú)菌水為對(duì)照,每個(gè)處理3次重復(fù),6 d后計(jì)算孢子萌發(fā)率,結(jié)果見(jiàn)表3。不同稀釋倍數(shù)的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取液均對(duì)鏈格孢菌分生孢子產(chǎn)生顯著性抑制作用,隨其稀釋倍數(shù)的增加,抑制作用也逐漸減弱,與對(duì)照相比,75%乙醇沉淀粗提液稀釋2倍鏈格孢菌孢子數(shù)為0.106×106個(gè),其抑制率達(dá)到84.7%,稀釋10倍其孢子數(shù)為0.253×106個(gè),孢子抑制率達(dá)到63.49%。而乙酸乙酯提取物稀釋2倍對(duì)孢子抑菌率為66.42%,稀釋10倍抑制率為71.87%,說(shuō)明strain-39的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物可較好地抑制鏈格孢菌的產(chǎn)孢。

    表3 Strain-39的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌分生孢子產(chǎn)生的影響Table3 Effect on production of conidium of A.alternata by 75%ethanol sediment and ethyl acetate extract produced from strain-39(/×106 CELLS·mL-1)

    表3 Strain-39的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌分生孢子產(chǎn)生的影響Table3 Effect on production of conidium of A.alternata by 75%ethanol sediment and ethyl acetate extract produced from strain-39(/×106 CELLS·mL-1)

    同列不同行大寫(xiě)字母不同代表差異顯著,P<0.05。

    提取液稀釋倍數(shù)2 10 CK乙酸乙酯提取物0.346B 0.413B 1.230A 75%乙醇沉淀提取液0.106A 0.253B 0.693B

    2.8 不同溫度處理對(duì)strain-39 75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物液抑菌活性的影響

    表4 不同溫度處理下strain-39的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌生長(zhǎng)的影響Table4 Effecton growth of of A.alternate by 75%ethanol sedimentand ethyl acetate extract produced from strain-39 under different temperature

    表4 不同溫度處理下strain-39的75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌生長(zhǎng)的影響Table4 Effecton growth of of A.alternate by 75%ethanol sedimentand ethyl acetate extract produced from strain-39 under different temperature

    同列不同行大寫(xiě)字母不相同代表差異顯著,P<0.05。

    溫度/℃75%乙醇沉淀提取物 乙酸乙酯提取物菌落直徑/mm 抑制率/% 菌落直徑/mm 抑制率/%50 75 100 121 CK 47.65±1.09A 45.36±2.33A 47.42±1.98A 18.56±1.63B—20.4 20.2 22.27 25 35.13 40.35±1.81A 42.52±1.08A 35.94±2.84B 28.92±1.23C—17.77 18.53 17.83 27.63 33.93

    取strain-39菌液75%乙醇沉淀粗提液和乙酸乙酯提取物,不同溫度處理后測(cè)定其抑制率。由表4可知,75%乙醇沉淀粗提液在50℃和120℃,隨著溫度的增加抑菌活性逐漸降低(P<0.05),乙酸乙酯提取物在50~100℃時(shí)無(wú)顯著性差異(P<0.05),在121℃時(shí),抑菌效果明顯降低(P<0.05)。兩者活性成分在不同溫度處理下抑菌活性不同,說(shuō)明Strain-39中抑菌活性物質(zhì)可能含有幾種,且總體抑菌效果受溫度影響不大。即使120℃高溫處理下,菌液成分仍保持部分抑菌活性。

    2.9 pH對(duì)strain-39的75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物的抑菌活性影響

    由表5可知,pH在2~12對(duì)不同成分均有抑菌活性,strain-39的75%乙醇沉淀提取液最適pH為4~6,且抑菌活性達(dá)到52.66%,抑菌活性隨著pH的增加而增加,無(wú)顯著性差異(P<0.05),說(shuō)明pH在酸性條件下活性比較穩(wěn)定,在堿性條件下隨著pH的增加活性逐漸降低,pH 12時(shí)活性顯著性降低(P<0.05),而乙酸乙酯提取物最適pH為6~8,在 pH 6時(shí),抑菌活性達(dá)到38.97%,與75%乙醇沉淀提取物處理液相比,活性較穩(wěn)定。在pH 2和pH 10條件下,仍具有活性。說(shuō)明菌液成分活性物質(zhì)具有較高酸堿穩(wěn)定性。

    表5 不同pH處理下strain-39的75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌生長(zhǎng)的影響Table5 Effect on the growth of A.alternata by 75%ethanol sedimentand ethyl acetate extract produced from strain-39 under different pH

    表5 不同pH處理下strain-39的75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌生長(zhǎng)的影響Table5 Effect on the growth of A.alternata by 75%ethanol sedimentand ethyl acetate extract produced from strain-39 under different pH

    同列不同行大寫(xiě)字母不同代表差異顯著,P<0.05。

    pH 75%乙醇沉淀提取物 乙酸乙酯提取物菌落直徑/mm 抑制率% 菌落直徑/mm 抑制率/%2 4 6 8 1 0 12 CK 27.74±2.39C 21.59±1.48C 38.97±4.81A 31.12±3.24B 31.48±0.74B 21.41±3.60C—20.87 16.70 15.57 22.03 26.46 30.07 32.90 36.44±3.59A 49.14±2.68A 52.66±1.93A 33.01±1.58B 19.41±4.07C 8.53±1.98D—24.93 27.06 21.03 23.80 23.67 27.13 34.53

    2.10 紫外線處理對(duì)strain-39的75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響

    表6 Strain-3975%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物在紫外處理下對(duì)鏈格孢菌生長(zhǎng)的影響Table6 Effecton the growth of A.alternata by 75%ethanol sedimentand ethyl acetate extract produced from strain-39 under UV

    同列不同行大寫(xiě)字母不同代表差異顯著,P<0.05。

    紫外處理/min 75%乙醇沉淀提取物 乙酸乙酯提取物菌落直徑/mm 抑菌率% 菌落直徑/mm 抑制率/%30 60 90 CK 20.23 23.23 24.77 37.07 45.32±4.35A 37.25±2.75B 33.23±2.06B—23.87 28.54 31.7 37.7 41.02±6.35A 24.32±1.49B 15.89±1.44B—

    由表6可知,在紫外照射下菌液不同成分都具有一定的抑菌活性,在紫外下照射30min,strain-39的75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物的抑菌效果最高,隨著紫外照射的時(shí)間延長(zhǎng)乙酸乙酯提取物的抑菌活性顯著性降低(P<0.05),在90min時(shí)抑菌效果最弱,而75%乙醇沉淀提取物在處理90min后抑菌活性無(wú)顯著變化。整體來(lái)說(shuō)不同菌液成分經(jīng)紫外處理后仍保持一定的抑菌活性。

    3 討論

    本試驗(yàn)從新鮮辣椒果肉內(nèi)篩選出一株對(duì)茄科鏈格孢菌具有抑菌效果的內(nèi)生拮抗菌,通過(guò)16SrDNA鑒定為黏質(zhì)紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa),該菌株能夠明顯降低鏈格孢菌的致病力,具有成為果蔬采后鏈格孢菌抑制劑和作為天然殺菌劑的廣泛應(yīng)用前景。

    對(duì)該菌株的菌液成分75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物抑菌活性進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果發(fā)現(xiàn)strain-39的75%乙醇沉淀提取物和乙酸乙酯提取物均具有良好的抗菌活性。strain-39在鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)和發(fā)育、孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)等都具有抑制作用,表明拮抗菌strain-39有效抑制了鏈格孢菌的生長(zhǎng)、繁殖等各個(gè)環(huán)節(jié),且對(duì)鏈格孢菌侵染循環(huán)的抑制是各個(gè)環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果,具有廣泛的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。

    防腐保鮮試驗(yàn)結(jié)果顯示strain-39菌液成分對(duì)抵御病原真菌的侵入,減少腐爛率,在防腐保鮮方面起到了重要作用,鏈格孢菌是茄科植物常見(jiàn)的病原菌,因此考慮將其替代化學(xué)殺菌劑用于果蔬采后保鮮方面,有望為食品防腐尋求新的技術(shù)途徑。

    Strain-39分泌的抗菌物質(zhì)主要為低分子量抗菌素和胞外蛋白[14,15]。菌株strain-39 75%沉淀提取物在高溫處理后對(duì)鏈格孢菌抑制效果逐漸降低,但不是很明顯,是否為抑菌蛋白有待進(jìn)一步研究。而乙酸乙酯提取物在121℃時(shí)抑菌活性明顯下降,說(shuō)明strain-39對(duì)鏈格孢菌的抑菌作用是為多種活性物質(zhì)作用的共同結(jié)果,后期還將進(jìn)一步分離純化strain-39菌株代謝物的抑菌活性成分,并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,進(jìn)而對(duì)所分離出的各組分的抑菌活性和相互作用做更深入的研究。

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