GM—CSF與創(chuàng)面修復(fù)

趙鋒

糖尿病相關(guān)性潰瘍、靜脈瘀滯性潰瘍、燒傷殘余創(chuàng)面、深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面以及各種原因不明的難愈性創(chuàng)面，在臨床上已經(jīng)成為常見病、多發(fā)病，而關(guān)于這類疾病的治療一直是比較棘手的問題，也是多年來中外學(xué)者探討的熱點(diǎn)。創(chuàng)傷愈合是一個動態(tài)的、復(fù)雜的、多細(xì)胞協(xié)作的過程。該過程中設(shè)計的細(xì)胞包括：角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及血小板等，在炎癥反應(yīng)以及愈合過程中這些細(xì)胞遷移、浸潤以及增殖分化，最終修復(fù)創(chuàng)面。這個過程被體內(nèi)的復(fù)雜的信號系統(tǒng)調(diào)控，包括許多生長因子、細(xì)胞因子以及化學(xué)因子，其中比較重要的有EGF、 VEGF、GM_CSF、 PDGF、CTGF以及IL等[1]。本文主要參閱有關(guān)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granubcyte/macrophage colony-stimulating factor GM-CSF）與創(chuàng)面修復(fù)的研究文獻(xiàn)，對GM-CSF在創(chuàng)面修復(fù)中的作用及應(yīng)用綜述如下。

1 GM-CSF的來源、理化特性以及與創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)的生物學(xué)特性

GM-CSF是一種多功能生長因子，最初作為免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于化療放療后以及嚴(yán)重感染等免疫低下患者。GM-CSF是由127個氨基酸組成的蛋白質(zhì)分子，是具有2個N-糖基化位點(diǎn)和3個O-糖基化位點(diǎn)的糖蛋白，含有四個半胱氨酸組成的2個二硫鍵，分子量從14.5～32kd不等的9條蛋白質(zhì)帶組成[2]。GM-CSF由活化的T細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等分泌，并可以通過自分泌及旁分泌的方式作用于這些細(xì)胞，影響其趨化、增殖和成熟[3-4]。創(chuàng)面上的GM-CSF來源于炎癥反應(yīng)細(xì)胞（如：巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞）、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，其中以角質(zhì)細(xì)胞為主[5]。GM-CSF在正常皮膚以及血液中含量極低，難以檢測到，形成創(chuàng)面或者炎癥刺激后局部皮膚以及血液中GM-CSF水平明顯升高，提示其與創(chuàng)面局部反應(yīng)有關(guān)。GM-CSF通過與靶細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，發(fā)揮多種生理作用。人體內(nèi)有多種細(xì)胞存在GM-CSF受體，如：粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的前體細(xì)胞、成熟中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、漿細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。人和小鼠GM-CSF受體均由α、β兩條鏈組成，其中α鏈?zhǔn)沁B接亞單位，和配體結(jié)合，β鏈主要和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。GM-CSF與受體結(jié)合后，刺激膜受體胞內(nèi)部分的蛋白酪氨酸磷酸化，激活酪氨酸激酶，RAS以及絲裂原活化蛋白激酶等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[6-7]。

2 GM-CSF與創(chuàng)面愈合

GM-CSF最初作為造血刺激因子以及免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于化療放療后和嚴(yán)重感染等患者。自1989年Siena等[8]發(fā)現(xiàn)GM-CSF在治療口腔黏膜炎以及口腔潰瘍具有良好效果后，關(guān)于GM-CSF與創(chuàng)面愈合的研究逐漸成為研究熱點(diǎn)，并取得了豐富成果。

2.1 局部注射GM-CSF對創(chuàng)面愈合作用的觀察：研究早期階段，由于還未研制出GM-CSF的外用劑型，在臨床試驗(yàn)以及動物實(shí)驗(yàn)中一般采用創(chuàng)面局部注射GM-CSF的方式觀察其對創(chuàng)面愈合效果，主要應(yīng)用于各種難愈性創(chuàng)面。早在1999年，Da Costa等[9]把GM-CSF注射于麻風(fēng)患者創(chuàng)面周圍，發(fā)現(xiàn)其可以有效地促進(jìn)創(chuàng)面愈合。2000年，同樣采用創(chuàng)面局部注射的方法，Groves等[10]證實(shí)GM-CSF可以引起局部組織中炎性細(xì)胞浸潤增加，并誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞增殖；激活單核巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)表皮細(xì)胞遷移，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生表達(dá)從而促進(jìn)瘀滯性潰瘍，壞疽性膿皮病以及手術(shù)切口的愈合。2001年，F(xiàn)ernberg等[11]將GM-SCF局部注射到癌癥手術(shù)前后放療導(dǎo)致的慢性潰瘍創(chuàng)面，并取得了顯著療效。局部注射GM-CSF可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合在動物實(shí)驗(yàn)中也得到有力證實(shí)。2002年，Vargel等[12]通過藥物外滲的方法制作了大鼠皮膚軟組織潰瘍模型，并將GM-CSF局部注射到潰瘍創(chuàng)面周圍，發(fā)現(xiàn)其可以有效地促進(jìn)皮膚軟組織壞死創(chuàng)面或者潰瘍創(chuàng)面的愈合。糖尿病繼發(fā)性創(chuàng)面由于微血管病變、周圍神經(jīng)性病變等原因?qū)е录?xì)胞增殖受抑和膠原代謝障礙，較難愈合，一直是困擾臨床的難題，因而成為研究熱點(diǎn)。在既往研究中，通過創(chuàng)面局部注射GM-CSF或者是均勻滴用GM-CSF均可以促進(jìn)糖尿病足慢性神經(jīng)性潰瘍和糖尿病脂性漸進(jìn)性壞死患者小腿慢性潰瘍的愈合，且復(fù)發(fā)率低[13]。中外學(xué)者均有研究表明，糖尿病小鼠創(chuàng)面中GM-CSF較正常情況下有所減少。方勇等[14]觀察到傷后3天糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合率較對照組明顯降低，傷后7天差異最明顯，糖尿病組中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤在創(chuàng)面愈合早期顯著少于對照組，而在后期較對照組略為增多。同時，通過ELISA法檢測不同時段創(chuàng)面組織中GM-CSF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)糖尿病組和對照組創(chuàng)面GM-CSF均于創(chuàng)面形成后第1天即有明顯升高，但是糖尿病組到達(dá)峰值時間明顯延遲。Fang等[15]也觀察到在糖尿病小鼠創(chuàng)傷模型早期，糖尿病小鼠創(chuàng)面表達(dá)GM-CSF的量較正常小鼠下降了50%。這從另外一個角度說明，GM-CSF在創(chuàng)面愈合中的重要作用。

2.2 局部外用GM-CSF水凝膠對創(chuàng)面愈合作用的觀察：隨著外用GM-CSF劑型的出現(xiàn)，局部外用GM-CSF是否可以加速創(chuàng)面愈合成為許多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面因?yàn)闊齻疃容^深且不具有植皮手術(shù)指征，保守治療一直是主要治療方案，療程相對較長，容易感染，成為治療難點(diǎn)。Zhang等[16]將GM-CSF水凝膠應(yīng)用于深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面，并對創(chuàng)面全部愈合的時間以及不同時間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率等指標(biāo)進(jìn)行分析，證實(shí)GM-CSF水凝膠可以顯著促進(jìn)深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面的愈合。燒傷殘余創(chuàng)面常在深度燒傷治療后期出現(xiàn)于Ⅲ度燒傷創(chuàng)面皮片間隙，深Ⅱ度創(chuàng)面，以及取皮較深的供皮區(qū)，肉芽蒼老、水腫，在肉芽創(chuàng)面或已愈皮膚上出現(xiàn)潰瘍或糜爛面，難以治愈。邱學(xué)文等[17]將重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子凝膠局部外用于燒傷殘余創(chuàng)面，并觀察用藥后不良反應(yīng)和創(chuàng)面愈合時間，以及不同時間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率、總有效率，證實(shí)局部外用rhGM-CSF凝膠能促進(jìn)燒傷后殘余創(chuàng)面愈合，且有較好的安全性。

2.3其他有關(guān)GM-CSF與創(chuàng)面修復(fù)的報道：關(guān)于干細(xì)胞以及祖細(xì)胞的研究有很多，并且涉及各個領(lǐng)域，已經(jīng)應(yīng)用到創(chuàng)面治療中。在關(guān)于干細(xì)胞促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制研究中，發(fā)現(xiàn)由干細(xì)胞分化而來的子代細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子是促進(jìn)創(chuàng)面愈合的重要因素。Templin等[18]將造血祖細(xì)胞及其培養(yǎng)液注射到鼠創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)創(chuàng)面成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及上皮細(xì)胞增殖與分化，從而促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。檢測發(fā)現(xiàn)造血祖細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子以及培養(yǎng)液成分中含有GM-CSF。無獨(dú)有偶，Lee等[19]將人胚胎干細(xì)胞來源的前體上皮細(xì)胞培養(yǎng)液局部外用并注射到創(chuàng)面周圍，觀察發(fā)現(xiàn)可以加速創(chuàng)面肉芽組織的生長以及再上皮化并可以增強(qiáng)已愈合創(chuàng)面的強(qiáng)度和韌性，通過對該培養(yǎng)液成分的分析發(fā)現(xiàn)，其含有GM-CSF等細(xì)胞因子。局限性腸炎以及慢性潰瘍性結(jié)腸炎等消化道炎癥的一個重要體征就是腸粘膜潰瘍，具有難治愈和反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)，是困擾臨床的難題。Bernasconi等[20]研究證實(shí)GM-CSF在治療這類疾病中有確切的效果，可以促進(jìn)損傷粘膜上皮的修復(fù)，加速潰瘍的再上皮化，減輕臨床癥狀，并檢測到在治療過程中單核細(xì)胞數(shù)量增加。

3 GM-CSF促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制

慢性創(chuàng)面愈合與組織修復(fù)的基本病理生理過程包括炎癥反應(yīng)期、細(xì)胞增殖期和組織重塑期，而急性創(chuàng)面的出現(xiàn)還往往伴隨出血及止血期，這幾個過程相互重疊而又按一定順序進(jìn)行。研究證實(shí)GM-CSF可以啟動并參與創(chuàng)面修復(fù)的每一個過程[10]。

3.1 GM-CSF與止血期：Kaplan 等[21]發(fā)現(xiàn)局部注射GM-CSF可以加快損傷部位出血速度。2007年，Moosbauer 等[22]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)GM-CSF可以通過聯(lián)合血小板活化因子促進(jìn)組織因子的轉(zhuǎn)錄和釋放，加速止血過程。

3.2 GM-CSF與炎癥反應(yīng)期：炎癥反應(yīng)是一個復(fù)雜的過程，各種炎性因子、細(xì)胞因子以及細(xì)胞相互影響，相互作用。其中中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的滲出和吞噬作用是炎癥反應(yīng)的重要特征，可以吞噬和降解細(xì)菌、免疫復(fù)合物、異物以及壞死組織碎片，發(fā)揮抗感染和清創(chuàng)作用，是創(chuàng)面修復(fù)的前提和基礎(chǔ)，是愈合過程中的重要環(huán)節(jié)。研究證實(shí)，GM-CSF對中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞具有趨化作用，可以增強(qiáng)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬作用，加速局部壞死組織的脫落及對入侵細(xì)菌的防御能力；并可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞合成分泌有利于創(chuàng)面愈合的細(xì)胞因子和生長因子，如：PDGF、FGF、EGF、VEGF等[5，23-24]。Canturk[25]給予小鼠全身應(yīng)用GM-CSF，然后制作切割傷模型，觀察血液中性粒細(xì)胞計數(shù)和功能，皮膚組織切片，以及皮膚中羥基脯氨酸含量，然后和應(yīng)用生理鹽水的對照組比較，發(fā)現(xiàn)GM-CSF可以顯著增加血液中性粒細(xì)胞的計數(shù)并可以增強(qiáng)其吞噬功能，并且可以增強(qiáng)愈合組織的韌度。2008年，Kim [26]通過非侵入性的免疫熒光成像技術(shù)結(jié)合中性粒細(xì)胞遺傳標(biāo)記呈現(xiàn)了炎癥過程中中性粒細(xì)胞向創(chuàng)面的浸潤以及增殖的動態(tài)過程，為炎癥過程中中性粒細(xì)胞的浸潤提供了更為直觀形象的證據(jù)；而GM-CSF是該過程的強(qiáng)烈刺激因子，甚至可以達(dá)到像金黃色葡萄球菌一樣的刺激效果。Fang等[24]制作GM-CSF基因敲除小鼠皮膚損傷模型，觀察傷口愈合率、再上皮化程度以及新生血管密度，并和對照組正常小鼠對比，發(fā)現(xiàn)以上觀察指標(biāo)明顯低于對照組，且創(chuàng)面炎性細(xì)胞浸潤顯著減少，創(chuàng)面IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白、巨噬細(xì)胞炎性蛋白的表達(dá)明顯降低。這從相反的角度表明：GM-CSF在炎癥反應(yīng)期可以分泌相關(guān)炎性因子和細(xì)胞因子，趨化炎性細(xì)胞浸潤并增強(qiáng)炎性細(xì)胞功能，在炎癥期發(fā)揮重要功能。

3.3 GM-CSF與增生期：各種難愈性創(chuàng)面的修復(fù)過程往往伴有慢性炎癥，這種修復(fù)過程一般首先通過肉芽組織增生、溶解、吸收損傷局部的壞死組織以及其他異物，并填補(bǔ)組織缺損，同時創(chuàng)緣和創(chuàng)面基底也有上皮組織增生，覆蓋于肉芽組織表面，完成修復(fù)。肉芽組織在組織損傷后2～3天內(nèi)即可出現(xiàn)，由新生薄壁的毛細(xì)血管以及增生的成纖維細(xì)胞構(gòu)成，并伴有炎性細(xì)胞浸潤，這一過程包括：血管生成、成纖維細(xì)胞增殖和遷移、細(xì)胞外基質(zhì)成分的積聚和纖維組織的重建。作為肉芽組織主要成分細(xì)胞的成纖維細(xì)胞，是創(chuàng)面修復(fù)過程中最重要的細(xì)胞，在肉芽組織形成、傷口收縮，細(xì)胞外基質(zhì)及膠原合成、瘢痕形成等方面起重要作用。已有研究證實(shí)，正常人皮膚成纖維細(xì)胞表面表達(dá)GM-CSF受體[27]。Postiglione等[28]研究表明GM-CSF能刺激成纖維細(xì)胞表達(dá)GM-CSF受體以及細(xì)胞增殖，還能促進(jìn)細(xì)胞肌動蛋白和纖粘連蛋白表達(dá)，增加細(xì)胞外基質(zhì)合成。另外，GM-CSF對成纖維細(xì)胞的刺激作用似乎隨創(chuàng)面部位不同而變化。Brem等[29]在慢性創(chuàng)面不同部位取活性組織，提取成纖維細(xì)胞并在體外培養(yǎng)，嚴(yán)格傳代，使其細(xì)胞保留原有的表型特征，然后將GM-CSF作用于細(xì)胞，觀察發(fā)現(xiàn)：創(chuàng)面愈合遲滯創(chuàng)緣來源的成纖維細(xì)胞幾乎沒有遷移能力，而愈合活躍創(chuàng)緣的成纖維細(xì)胞遷移最活躍，創(chuàng)面基底來源的成纖維細(xì)胞遷移活性居中。雖然大量研究表明GM-CSF可以增強(qiáng)成纖維細(xì)胞的遷移、分化、增殖以及合成能力，但是并非所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都是支持這個結(jié)論，Shao等[30]在體外培養(yǎng)條件下將GM-CSF作用于成纖維細(xì)胞，沒有觀察到GM-CSF對纖維細(xì)胞的增殖具有明顯的促進(jìn)作用。這種差別也許和實(shí)驗(yàn)條件、觀察指標(biāo)、檢測方法有關(guān)，也可能還有一些影響細(xì)胞增殖分化的因素需要進(jìn)一步研究。

新生毛細(xì)血管作為肉芽組織的重要組成部分，為細(xì)胞分化增殖提供營養(yǎng)成分，在組織再生與創(chuàng)面修復(fù)過程起著至關(guān)重要的作用。大量研究表明，GM-CSF能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的趨化、增殖，從而加速肉芽組織中的血管形成[5]。Wang 等[31]發(fā)現(xiàn)GM-CSF能誘導(dǎo)培養(yǎng)基中鼠骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖分化，其細(xì)胞表現(xiàn)出典型 的內(nèi)皮細(xì)胞樣形態(tài)，并形成集落內(nèi)皮細(xì)胞。Fang等[32]研究發(fā)現(xiàn)，GM-CSF基因剔除小鼠燒傷后，創(chuàng)面中新生血管化較野生型小鼠明顯減少，創(chuàng)面愈合時間延遲，說明GM-CSF通過可以調(diào)控創(chuàng)面愈合過程中的血管新生而促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。

創(chuàng)面修復(fù)過程中，首先是肉芽組織增生吸收清除致病因子以及壞死組織，填補(bǔ)組織缺損，然后是上皮組織增生覆蓋于肉芽組織之上最終完成創(chuàng)面修復(fù)，所以上皮組織增生是創(chuàng)面修復(fù)過程中關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。中外學(xué)者均有相關(guān)報道，認(rèn)為GM-CSF可以促進(jìn)上皮組織增生。方勇等[33]將GM-CSF凝膠用于治療糖尿病小鼠創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)GM-CSF可以顯著加速創(chuàng)面再上皮化，增加膠原蛋白合成從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。國外也有相應(yīng)研究證實(shí)，在創(chuàng)面愈合增生期GM-CSF可以刺激新生角化上皮細(xì)胞增殖、遷移、分化，從而加速創(chuàng)面的再上皮化[5，34]。

4 展望

各種原因?qū)е碌碾y愈性創(chuàng)面在臨床中已經(jīng)成為常見病、多發(fā)病，治療方法一般包括手術(shù)以及保守治療。但是許多患者由于年齡、一般身體狀況以及思想傳統(tǒng)等原因或者受經(jīng)濟(jì)限制而選擇保守治療。目前基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)以及臨床試驗(yàn)的大部分結(jié)論均證實(shí)GM-CSF具有促進(jìn)難愈性創(chuàng)面愈合的作用，GM-CSF參與到創(chuàng)面修復(fù)的各個環(huán)節(jié)，其參與早期炎性反應(yīng)階段的分子生物學(xué)機(jī)制研究的相對較多，具體機(jī)制相對清楚。GM-CSF調(diào)節(jié)創(chuàng)面組織生長促進(jìn)修復(fù)的具體機(jī)理研究的相對較少，目前相關(guān)數(shù)據(jù)較少，將成為進(jìn)一步研究的熱點(diǎn)問題。另外，關(guān)于GM-CSF促進(jìn)創(chuàng)面的研究多數(shù)以創(chuàng)面局部注射或者外用為主，目前認(rèn)為創(chuàng)面周圍注射途徑不僅創(chuàng)面愈合速率要比局部外用要快，而且用藥劑量要更加標(biāo)準(zhǔn)，但是大面積創(chuàng)面周圍注射尚存在諸多不便。如何更為科學(xué)地應(yīng)用GM-CSF治療難愈性創(chuàng)面，以及如何合理地與其他外用藥物或者創(chuàng)面修復(fù)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，尚待進(jìn)一步探討。

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[收稿日期]2013-02-23 [修回日期]2013-03-21

編輯/李陽利