食品中甜菊糖甙檢測方法研究進展

尤繼明等

摘 要：介紹了甜菊糖甙的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，并綜述食品中甜菊糖甙的檢測方法，如薄層層析法、分光光度法、毛細管電泳法、液相色譜法等，并展望了食品中甜菊糖甙檢測的前景。

關(guān)鍵詞：甜菊糖甙；食品；檢測方法

中圖分類號 TS201.1 文獻標識碼 B 文章編號 1007-7731（2013）06-140-03

甜菊糖甙（Stevia）又稱作甜菊糖（Stevia sugar），為甜葉菊葉子提取物，不含糖分和熱量；色澤白色至微黃色，口感適宜、無異味，是發(fā)展前景廣闊的新糖源。甜菊糖苷是目前世界已發(fā)現(xiàn)并經(jīng)我國衛(wèi)生部批準使用的甜味劑，其天然低熱值并且非常接近蔗糖口味，是繼甘蔗、甜菜糖之外第3種有開發(fā)價值和健康推崇的天然甜味劑，被國際上譽為“世界第三糖源”，其具有高甜度、低熱量、安全無毒等特點，是一種可替代蔗糖的非常理想的甜味劑[1-3]。甜葉菊糖苷的物理、化學性能穩(wěn)定，無發(fā)酵性，無代謝性，長期食用不會使人發(fā)胖，特別適宜高血壓、糖尿病、肥胖病、齲齒病患者使用，由此甜菊糖甙廣泛應用于食品、飲料、調(diào)味料、釀酒、醫(yī)藥、日用化工、釀酒、化妝品等行業(yè)。甜菊糖主要含有甜菊糖苷（stevioside，SS）、萊鮑迪苷A（rebaudioside A，RA） 、萊鮑迪苷C[7]（rebaudioside C，RC）等8種成分[4]，萊鮑迪苷A是其中品質(zhì)最好的成分。

20世紀50年代人工種植甜葉菊成功后，日本、馬來西亞、中國、韓國、阿根廷、巴拉圭、巴西等20多個亞洲和拉美國家開始批準使用[5]，美國食品藥品管理局2008年批準使用甜葉菊提取物萊鮑迪苷A后，甜葉菊產(chǎn)業(yè)受到廣泛關(guān)注，我國衛(wèi)生部頒布的《食品安全國家標準 食品添加劑使用衛(wèi)生標準》（GB2760-2011） [6]規(guī)定甜菊糖甙的使用范圍為蜜餞、堅果及其仔類、糖果、膨化食品、糕點、調(diào)味品、飲料等食品，最大使用量按照生產(chǎn)需要適量使用。

目前，針對甜菊糖甙的檢測有以下幾種方法：薄層色譜法[7-8]、分光光度法[9]、毛細管電泳法[10-11]、高效液相色譜法[12-16]、流動注射分析法[17]等。

1 甜菊糖甙的理化性質(zhì)

甜菊甙結(jié)構(gòu)式為：

分子式為C38H60O18，分子量為804.86。甜菊糖甙為白色至淺黃色結(jié)晶或粉末，吸濕性不大。密度1.53g/cm3，熔點198℃，沸點963.3℃。易溶于水、乙醇，不溶于丙二醇或乙二醇，與蔗糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖等混合使用時，不僅甜菊糖苷甜味更純正，且甜度可起到協(xié)同增效效果。同時甜菊糖苷具有良好的耐熱耐光性，在pH值3～10范圍內(nèi)十分穩(wěn)定，易存放。溶液穩(wěn)定性好，在一般飲料食品的pH范圍內(nèi)，進行加熱處理仍很穩(wěn)定。甜菊糖苷在含有蔗糖的有機酸溶液中存放半年變化不大；在酸堿類介質(zhì)中不分解，可防止發(fā)酵、變色和沉淀；對光穩(wěn)定，長期儲存不會腐敗變質(zhì)；發(fā)熱量極低，其卡值基本接近零。

2 甜菊糖甙檢測方法進展

2.1 薄層層析法 薄層層析法（thin layer chromatography）又稱薄層色譜，是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種重要實驗技術(shù)，屬固—液吸附色譜，兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點，一方面適用于少量樣品（幾微克，甚至0.01μg）的分離；另一方面在制作薄層板時，把吸附層加厚加大，用來精制樣品，此法特別適用于揮發(fā)性較小或較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物質(zhì)，是較早用于甜菊糖的分析檢測方法之一。

張志[7]等選擇適宜的展開劑和顯色劑等建立了一種定性鑒別甜葉菊糖苷中含有Stevioside（St）和Rebaudioside A（RA）2種主要成分的實驗方法，此法對分離和測定它們不僅靈敏度高而且簡單易行，可作為甜菊糖苷測定的常規(guī)手段。王圣剛[8]等用薄層層析法對甜葉菊種子所含糖苷進行分析，比對不同顯色劑的顯色效果，找到了合適的顯色劑，定性分析了甜葉菊種子中糖苷成分。

2.2 分光光度法 分光光度法是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸光度或發(fā)光強度，對該物質(zhì)進行定性和定量分析的方法。甜菊糖苷的苷元是四環(huán)二萜類化合物，在C-4位上的羧基上連接著一個葡萄糖基，在C-13位上以槐糖形式連接2個葡萄糖基，構(gòu)成甜菊糖苷。水解條件下，甜菊糖苷可以脫落葡萄糖，與蒽酮試劑反應生成有色化合物，從而進行分析測量。

項秀珠[9]等用乙醚萃取法去除甜菊葉中的脂溶性雜質(zhì)；用無水乙醇為溶劑達到了提取完全之目的；提取液通過硅膠層析柱去除醇溶性雜質(zhì)，獲得了純度較高的甜菊甙提取液。提取液在酸性介質(zhì)中水解后，使甜菊甙基因上的葡萄脫落，與蒽酮試劑顯色反應產(chǎn)生綠色的穩(wěn)定溶液，在622nm處有一最大吸收峰，當甜菊甙含量在0～80μg/mL范圍內(nèi)符合比爾定律，建立了應用分光光度法測定甜菊甙的新方法。

2.3 毛細管電泳法 毛細管電泳是以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。甜菊糖苷可以在高電壓的驅(qū)動下，在毛細管中實現(xiàn)與樣品中其他各組分的分離，從而達到測定的目的。

邵寒娟[10]等人建立了一種用毛細管區(qū)帶電泳法篩選甜菊糖苷突變體的有效方法。根據(jù)實驗結(jié)果，優(yōu)化的電泳條件為：60mmol/L Tris硼酸緩沖液（pH8.0），柱溫30℃，工作電壓25kV。優(yōu)化條件下，甜菊苷（Stevioside）遷移時間的RSD為0.45%（15次），且在7.45×10-5～1.74×10-2mol/L的濃度范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系（r=0.999 4），甜菊主要糖苷在5min內(nèi)均可實現(xiàn)分離。劉露露[11]等將高效毛細管電泳法成功地運用到低熱量食品中斯替維苷（St）和萊鮑迪苷（RA）含量的檢測。研究試驗參數(shù)對分離、檢測的影響，得到優(yōu)化的試驗條件：在含有23%乙腈和7%甲醇的50mmol/L硼砂緩沖液（pH=10.10）中，RA和St在15min內(nèi)得到良好的分離。RA和St分別在0.05～10.0mg/mL和0.06～10.0mg/mL的范圍內(nèi)濃度與電泳峰面積呈良好的線性關(guān)系，檢測限分別為0.01mg/mL和0.02mg/mL。

2.4 高效液相色譜法 高效液相色譜法在經(jīng)典色譜理論的基礎(chǔ)上，采用了高壓泵、化學鍵合固定相高效分離柱、高靈敏專用檢測器等新實驗技術(shù)建立的一種液相色譜分析法，分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差的生化樣品及高分子和離子型樣品均可檢測，因此用途廣泛。高效液相色譜法是目前分析甜菊糖甙最常用的分析方法，常用的檢測器為二極管陣列檢測器、紫外檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器和示差折光檢測器。

吳巖[12]等建立了高效液相色譜法測定甜葉菊粗糖苷中甜菊苷含量的方法。采用zorbax 80A Extend-C18 4.6mm×150mm 4μm色譜柱，MeOH-水（68∶32，體積比）為流動相，流動相流速1.0mL/min，利用二極管陣列檢測器，確定最佳檢測波長203nm，通過外標法計算甜菊苷的含量。李紅[13]等利用大孔樹脂吸附法提取甜葉菊中甜菊糖苷，HPLC采用Zorbax-NH2（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，流動相為乙腈-水（78：22，體積比），梯度洗脫，流速0.8mL/min，柱溫30℃，測定波長210nm；進樣量15μL，測定了14份不同產(chǎn)地的甜葉菊樣品中甜菊糖苷含量。李愛峰[14]等人建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射分離與檢測甜菊糖中甜菊糖苷和萊鮑迪苷A的實驗方法。色譜分離使用Kromasil NH2柱（50mm×4.6mm，5μm），流動相為85%乙腈水溶液，柱流出物采用蒸發(fā)光散射檢測器檢測，漂移管溫度為85℃，空氣作載氣，流速為2.4L/min。甜菊糖苷和萊鮑迪苷A的線性范圍分別為0.05～3.0mg/mL、0.05～3.7mg/mL，平均加標回收率分別為97.63%、99.25%， 相對標準偏差分別為1.04%、1.27%。劉超[15]等采用Kromasil NH2柱（250mm×4.6mm，5μm），以乙腈：水=75∶25為流動相，采用質(zhì)譜檢測器鑒定甜葉菊糖中主要的成分，ST和RA質(zhì)量濃度分別為9.0～287.6mg/L和3.9～126.1mg/L時線性關(guān)系良好，兩者平均回收率分別為98.61%和97.40%，RSD分別為2.3%和1.3%（n=5）。趙永良[16]等色譜柱采用Kromasil NH2柱（250mm×4.6mm，5μm），乙腈∶水=80∶20為流動相，采用紫外檢測器和運用外標法測定甜菊糖甙中的R-A。其質(zhì)量濃度在0.1～1.0mg/mL時線性關(guān)系良好，平均回收率在101.51%，RSD為1.22%。

2.5 其他檢測方法 流動注射分析是20世紀70年代中期誕生并迅速發(fā)展起來的溶液自動在線處理及測定的現(xiàn)代分析技術(shù)。流動注射化學發(fā)光分析法是利用具有流速的試劑流的容量測定，即用聚四氟乙烯管代替燒杯和容量瓶，通過流動注射進行分析的方法。楊丹[17]等人利用以下原理：基于在NaOH堿性介質(zhì)中，F(xiàn)e（CN）63-可以直接氧化甜葉菊糖苷產(chǎn)生強的化學發(fā)光這一現(xiàn)象，并結(jié)合流動注射分析技術(shù)，提出了一種直接化學發(fā)光測定甜葉菊糖苷的新方法。該方法測定甜葉菊糖苷的線性范圍為0.05～10mg/mL，檢出限為0.05mg/mL。該方法已經(jīng)成功用于甜葉菊葉片中糖苷含量的測定。

3 研究展望

甜菊糖甙甜度高、熱量低，作為一種新型天然的甜味劑可廣泛應用于各類食品和飲料中。隨著甜菊糖甙的廣泛應用，食品中甜菊糖含量的檢測也越來越受到重視，也會有越來越多的檢測方法被開發(fā)出來。在實際檢測中，要基于不同的食品基質(zhì)，采取靈活的檢驗方法，既能提高檢測速度，又能滿足檢驗需求。

參考文獻

[1]朱煥鈴，劉景彬，謝印芝. 甜菊糖甙的性質(zhì)及在食品中的應用[J]. 食品研究與開發(fā)，2011，32（11）： 189-192.

[2]Li Jie，Chen Zhenbin，Di Duolong. Preparative separation and puri?cation of Rebaudioside A from Stevia rebaudiana Bertoni crude extracts by mixed bed of macroporous adsorption resins[J]. Food Chemistry，2012，132： 268-276.

[3]Tomas Vanek，Ales Nepovym，Pavel Valycek. Journal of food composition and analysis，2001，14： 383.

[4]張亞雄，胡為民， 胡濱.甜菊糖中A3甙分離方法初探[J]. 中國食品添加劑，1998（4）：48-49.

[5]邱洪冰，吳一華. 甜菊糖甙在食品飲料工業(yè)中的應用[J]. 添加劑，2010，13（3）： 38-40.

[6]GB2760-2011《食品安全國家標準 食品添加劑使用衛(wèi)生標準》[S].

[7]張志，滕祥金，郝再彬. 薄板層析法分析甜葉菊糖苷[J]. 中國調(diào)味品，2009，34（3）： 94-98.

[8]王圣剛，王貴民. 薄層層析法分析甜葉菊（Stevia Rebaudiana）種子糖苷[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學，2007，30（4）： 48.

[9]項秀珠，郭秀珠. 應用UV-260紫外分光光度計測定甜菊甙的研究[C]. 第七屆光譜分析學術(shù)討論會論文集，1996.

[10]邵寒娟，胡涌剛，丁亮，等. 利用毛細管電泳法分析甜菊糖苷的含量[J]. 植物學通報，2001，18（1）： 113-117.

[11]劉露露，顧正榮，饒琴. 毛細管電泳檢測低熱量食甜菊糖甙的含量[J]. 食品研究與開發(fā)，2009，30（4）： 113-116.

[12]吳巖，楊長志，劉永，等. 高效液相色譜法測定甜葉菊粗糖苷中甜菊苷的含量[J]. 食品工業(yè)科技，214-215.

[13]李紅，向增旭. HPLC法測定不同地甜葉菊中糖苷含量[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2002，40（8）： 306-307.

[14]李愛峰，孫愛玲，柳仁民，等. 高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射測定甜菊糖中甜菊糖苷和萊鮑迪苷A的含量[J]. 食品工業(yè)科技，2011，32（4）： 373-375.

[15]劉超，李來生，許麗麗，等. 高效液相色譜法測定甜葉菊糖中的 甜菊苷和菜鮑迪苷A[J]. 分析試驗室，2007，26（7）： 23-26.

[16]趙永良，崔媛，劉景彬，等. 高效液相色譜法測定甜菊糖甙中萊鮑迪甙A[J]. 食品科技，2009，34（9）： 294-296.

[17]楊丹，郝再彬. 流動注射化學發(fā)光法測定甜葉菊糖苷[J]. 化學工程師，2005，115（4）： 23-41.

（責編：徐世紅）