牛奶中黃曲霉毒素M1常見檢測方法比較

萬珊 朱曦 梁利妹 董文婷

摘要：黃曲霉毒素M1（ AFM1）是動物攝入黃曲霉毒素B1（AFB1）后在體內(nèi)經(jīng)羥基化形成的代謝產(chǎn)物，具有極強(qiáng)的毒性，存在于乳中。介紹了黃曲霉毒素M1（ AFM1） 的危害以及牛奶中黃曲霉毒素M1的薄層色譜（TLC）檢測法、高效液相色譜（HPLC）檢測法和快速檢測法，并比較了各種方法的優(yōu)缺點和適用范圍。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素 M1；危害；檢測方法；比較

中圖分類號：TS252.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1007-273X（2013）06-0078-03

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AF）主要是黃曲霉菌和寄生曲霉菌的代謝產(chǎn)物，之所以廣受重視是因為它是人類癌癥的一個重要的致癌源。至今已分離出的黃曲霉毒素及其衍生物有20多種，在天然食物中以黃曲霉毒素B1最為多見。在AF中，已知毒性大小順序為AFB1>AFM1>AFG1>AFB2>AFG。

黃曲霉毒素 M1（Aflatoxin M1，AFM1）是動物攝入黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）后在體內(nèi)經(jīng)羥基化形成的代謝產(chǎn)物，毒性僅次于AFB1，WHO將其列為ⅡB類致癌物。AFM1主要存在于動物的乳、腎臟、肝臟、蛋、肉和尿中，其中以乳中最為常見。

把發(fā)霉的谷物作為飼料，其中的黃曲霉毒素在24 h之后就能進(jìn)入奶中。王蕾指出黃曲霉毒素被動物食用后，一部分會蓄積在動物的體內(nèi)，另外一部分則會轉(zhuǎn)化到乳汁和尿液中，轉(zhuǎn)化率一般為3.45%～11.39%[1]，排出AFM1的量為AFB1攝入量的1%～3%[2]。

1 黃曲霉毒素M1的基本性質(zhì)及危害

黃曲霉毒素基本結(jié)構(gòu)由一個二呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰?fù)M成，前者為其毒性結(jié)構(gòu)，后者可能與其致癌作用有關(guān)。黃曲霉毒素M1一旦產(chǎn)生便很難消除，因為它對光、熱和酸都比較穩(wěn)定，熔點（裂解溫度）在299 ℃。牛奶常見的3種消毒方法都對它無可奈何。

黃曲霉毒素M1進(jìn)入人或動物體內(nèi)后，除抑制DNA、RNA合成外， 也抑制肝臟蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致人體中毒。其危害主要表現(xiàn)在3個方面：損害組織器官；致癌、致畸、致突變，引發(fā)動物及人類的肝癌、腎癌和胃癌等[3-5]；抑制免疫機(jī)能。其毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，主要危害的部位在肝臟。

2 牛奶中AFM1的限量

牛奶中AFM1限量取決于科學(xué)、社會和經(jīng)濟(jì)方面的諸多因素，這些因素相互影響、制約，綜合地決定牛奶中AFM1限量值。目前，世界各國對食品中AFM1的含量都制定出了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。牛奶中AFM1限量值采用0.05 μg/kg的國家最多，為34個，其中絕大部分國家是歐盟成員國以及與歐盟有貿(mào)易的非洲、亞洲、拉丁美洲部分國家，歐盟對嬰幼兒配方食品，包括嬰幼兒配方牛奶限量0.025 μg/kg。另一個限量值為0.5 μg/kg，有22個國家，包括美國、中國以及若干亞洲和歐洲國家。還有4個國家分別采用15、5、0.2 μg/kg以及不得檢出[6]。一些主要國家牛奶中AFM1的限量標(biāo)準(zhǔn)見表1。

3 牛奶中AFM1的檢測方法

3.1 薄層層析法（TLC法）

TLC法是測定牛奶中黃曲霉毒素的經(jīng)典方法，是通過肉眼比較定性或者半定量的檢測方法。其原理是將樣品經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，AFM1在紫外光（波長365 nm）下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層板上顯示熒光的最低檢出量與標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度相比較來測定含量。GB 5009.24～2010食品中黃曲霉毒素M1和B1的測定、ISO 14674：2005（IDF 190：2005）牛奶和奶粉黃曲霉毒素M1的測定、AOAC 974.17乳制品中黃曲霉毒素M1的測定和AOAC 980.21牛奶和奶酪黃曲霉毒素M1的測定就是采用的TLC法[7-10]。

TLC法的優(yōu)點在于不依賴特殊儀器，成本低，易于普及，雙向展開避免了雜質(zhì)干擾，被用于大規(guī)模的篩查研究中。雖然TLC法是牛奶中黃曲霉毒素M1 測定的官方規(guī)定方法之一，但是隨著高效液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)的發(fā)展，TLC的缺點也逐漸顯現(xiàn)：對樣品處理繁瑣，過程復(fù)雜，且提取和凈化效果不夠理想，雙向展開增加了操作步驟和時間，對人和環(huán)境污染系數(shù)較大。

3.2 高效液相色譜法（HPLC法）

HPLC法是利用免疫親和柱或C18柱將樣品中的AFM1萃取、凈化、濃縮、分離，再通過HPLC串聯(lián)不同檢測器進(jìn)行檢測。免疫親和柱是利用抗原抗體的特異性吸附特性， 親和柱只能特異性、選擇性地吸附AF，而其他雜質(zhì)則順利通過柱子， 然后再利用洗脫液將AF洗脫下來。該方法大大簡化了樣品的前處理過程， 同時利用高效液相色譜進(jìn)行定量和定性， 可以同時測出AF的總量和AFM1、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2各自含量。我國GB/T 23212～2008牛奶和奶粉中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1和M2的測定和GB 5413.37～2010乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定（第一法免疫親和層析凈化液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法）均是采用免疫親和柱萃取分離AFM1[11，12]。熒光（Fluorescence detection， FLD）、質(zhì) 譜（Mass spectrometry， MS）等的定量測定被廣泛用于牛奶中AFM1的檢測。

3.2.1 HPLC-FLD 配以熒光檢測器的反相HPLC法已經(jīng)成為檢測黃曲霉毒素的主要測定方法，這是因為反相HPLC方法具有同時分離多種黃曲霉毒素的功能和快速、高效、靈敏、定量準(zhǔn)確的優(yōu)點，而且不受樣品的沸點、熱穩(wěn)定性和分子量等的限制；熒光檢測器具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、分離能力強(qiáng)、干擾峰少的優(yōu)點，而牛奶中AFM1具有較強(qiáng)的發(fā)射熒光特性。

3.2.2 HPLC-MS 質(zhì)譜法是通過將試樣分子裂解為分子離子和各種離子碎片的集合，按質(zhì)荷比（m/z）大小進(jìn)行分離、記錄的分析方法。MS檢測器具有更高的選擇性、對分析物分子標(biāo)識的確證、可用同位素標(biāo)記作為內(nèi)標(biāo)等優(yōu)勢，HPLC-MS比傳統(tǒng)液相檢測器靈敏度更高，選擇性更強(qiáng)，提供了可靠、精確的相對分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)信息，簡化了試驗步驟，節(jié)省了樣品準(zhǔn)備時間和分析時間，廣泛應(yīng)用于AFM1的檢測中。ISO 14501：2007（IDF 171：2007）牛奶和奶粉黃曲霉毒素M1含量的測定和我國GB 5413.37-2010乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定（第一法免疫親和層析凈化 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法）采用的就是LC-MS法檢測奶中的黃曲霉毒素M1[12]。

3.3 免疫層析凈化熒光分光度法

免疫層析凈化熒光分光度法的原理是將試樣經(jīng)過離心、脫脂、過濾后，濾液經(jīng)過含有黃曲霉毒素M1特異性單克隆抗體的免疫親和柱層析凈化，除去其他雜質(zhì)， 再洗脫下黃曲霉毒素M1，用熒光光度計測定黃曲霉毒素M1的含量。其中測定時是先用熒光光度計標(biāo)定溶液進(jìn)行熒光光度計校準(zhǔn)，再進(jìn)行AFM1的含量的測定。優(yōu)點在于分析過程中不使用AFM1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，避免了操作人員造成的污染危險，不用擔(dān)心AFM1標(biāo)準(zhǔn)品的購買困難，具有準(zhǔn)確、快速、安全、簡單等特點，可以滿足少量和批量樣品的檢測需要[13]。我國GB 5413.37-2010乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定（第三法免疫層析凈化熒光分光度法）采用的就是此種方法檢測奶中的黃曲霉毒素M1[12]。

3.4 快速檢測法

3.4.1酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在黃曲霉毒素分析過程中是最為引人注目的，因為它們具有高度的靈敏度和選擇性，而且具有快速和大批量檢測的能力。ELISA的原理是樣品中的黃曲霉毒素與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競爭抗體，在固相載體表面形成抗原抗體復(fù)合物。洗除多余抗體成分，加入酶標(biāo)Ⅱ抗，與抗體反應(yīng)通過酶催化顯色劑顯色，根據(jù)顯色的深淺來判斷樣品中黃曲霉毒素的含量。

ELISA具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)、成本低等特點，大大減輕了工作人員的勞動量，樣品不需特殊處理，直接測定，儀器操作簡單，適合于AFM1大批樣品的檢測篩選，可用于現(xiàn)場檢測。我國DB33/T 556-2005乳和乳粉中黃曲霉毒素M1的測定使用酶聯(lián)免疫吸附法，ISO 14675：2003（IDF186：2003）牛奶和牛奶制品，競爭酶聯(lián)免疫分析的標(biāo)準(zhǔn)化描述指南.黃曲霉毒素M1含量的測定即為ELISA法[14，15]。競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗從1995年起已成為AOAC檢測黃曲霉毒素的官方方法。

3.4.2 膠體金法 膠體金法基于競爭法膠體金免疫層析技術(shù)，用于快速篩查含有AFM1 的液態(tài)奶、奶粉（含嬰兒奶粉）和飼料等樣品。此法將檢測樣品液加入速測卡上的樣品孔，檢測液中的AFM1與金標(biāo)卡上的金標(biāo)抗體結(jié)合形成復(fù)合物，若AFM1在檢測液中濃度低于設(shè)定檢測靈敏度值（陰性樣本），未結(jié)合的金標(biāo)抗體流到T區(qū)時，被固定在膜上的抗原捕獲，形成一條可見的T線；若AFM1 濃度高于設(shè)定檢測靈敏度值，金標(biāo)抗體即與AFM1全部形成復(fù)合物，不再與T線處抗原結(jié)合，T線不可見。C線為質(zhì)控線，出現(xiàn)則說明該速測卡有效。鄧省亮等[16]、孫秀蘭等[17]等分別制備和研究了膠體金檢測卡以及樣品基質(zhì)對試紙條信號靈敏度的影響，并為消除這些影響提供了經(jīng)驗。市面上的速測卡盒在2～8 ℃可穩(wěn)定保存4個月，檢測一個樣品費用僅需幾十元。此方法快速便捷，操作簡單，成本低，適用于大量篩查牛奶中AFM1，節(jié)省了人力、物力、財力。

3.4.3 SNAP法 利用酶聯(lián)免疫競爭原理，樣品中殘留的黃曲霉毒素M1與定量特異性酶標(biāo)抗體反應(yīng)，多余的游離酶標(biāo)抗體則與酶標(biāo)板內(nèi)的包被抗原結(jié)合，通過流動洗滌，加入酶顯色底物顯色后，與標(biāo)準(zhǔn)點比較定性。GB 5413.37～2010 乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定（第四法）和NY 1664～2008 牛乳中黃曲霉毒素M1的測定均采用此法[12，18]。

4 小結(jié)

目前， 人們逐漸認(rèn)識到牛乳具有提高機(jī)體免疫力、增強(qiáng)體質(zhì)等優(yōu)點， 已成為不可缺少的常用食品，牛奶的安全性也日益受到重視，所以對于牛奶中AFM1的污染控制是牛奶生產(chǎn)中的重中之重。

薄層層析法是經(jīng)典方法，一般實驗室均能完成，雖不斷改進(jìn)，但在抗干擾、精密度方面仍有缺陷，且步驟繁瑣，對人員危害大。親和柱HPLC-FLD靈敏度、精密度等均可滿足AF檢測要求。HPLC-MS具有預(yù)處理簡單、檢測速度快、靈敏度高的優(yōu)點，可以滿足少量和批量樣品的檢測需要，但對于儀器要求較高，成本也較高。免疫層析凈化熒光分光度法測定過程中不使用AFM1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，避免污染危險，具有準(zhǔn)確、快速、安全、簡單等特點。根據(jù)其特點這幾種方法適合實驗室檢測。ELISA、膠體金法和SNAP法適合于現(xiàn)場篩查。ELISA使用安全，操作簡便、快捷，適合大批量樣品篩查，但適用酶、抗體對保存條件、時間又有一定要求。膠體金法和SNAP法更加方便快捷，但主要用于定性。此外，乳及乳制品特別是生乳的貯存條件特殊，不宜長時間運輸貯存，快速檢測對大規(guī)模監(jiān)測具有重要意義。同時，快速的現(xiàn)場檢測可以提高檢測效率，加大監(jiān)測范圍和力度，保證牛奶質(zhì)量安全。采用快速檢測技術(shù)（最好是膠體金速測卡）初步篩查后，再用HPLC-FLD法、HPLC-MS法等定量法對快速法篩選出的陽性或超標(biāo)樣品進(jìn)一步確證，這可能是解決大批量牛奶檢測的最好方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王 蕾.牛奶中黃曲霉毒素M1檢測方法的建立及飼料中黃曲霉毒素對牛奶品質(zhì)的影響[D].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[2] VELASCO R M L， DELSO M M C， ESCUDERO D O. ELISA and HPLC determination of the occurrence of alfatoxin M1 in raw cow's milk[J].Food Addit Contam，2003（20）：276-280.

[3] 陳愛民，徐耀初.AFT致肝癌的分子機(jī)制及其化學(xué)預(yù)防[M] .國外醫(yī)學(xué)：衛(wèi)生學(xué)分冊，1998，25（5）：285-288.

[4] 卿中全，于炎湖.AFT對家禽生產(chǎn)性能和健康的影響[J] .中國飼料，2000（3）：35-37.

[5] MISHRA H N， CHITRANGADA D. A review on biological control and metabolism of aflatoxin[J]. Critical Reviews in Food Science and Nuteition，2003，43（3）：245-264.

[6] 黃良策，程建波，鄭 楠，等.牛奶中黃曲霉毒素M1檢測方法研究進(jìn)展[J]. 食品安全導(dǎo)刊，2012（3）：39-41

[7] GB 5009.24-2010，食品中黃曲霉毒素M1和B1的測定[S].

[8] ISO 14674：2005（IDF 190：2005），牛奶和奶粉黃曲霉毒素M1的測定[S].

[9] AOAC 974.17，乳制品中黃曲霉毒素M1的測定[S].

[10] AOAC 980.21，牛奶和奶酪黃曲霉毒素M1的測定[S].

[11] GB/T 23212-2008，牛奶和奶粉中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1和M2的測定[S].

[12] GB 5413.37-2010，乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定[S].

[13] 張 鵬，張藝兵，王 晶，等.牛奶及奶粉中黃曲霉毒素M1的快速測定[J].中國乳品工業(yè)，2002，30（6）：30-32.

[14] DB33/T 556-2005，乳和乳粉中黃曲霉毒素M1的測定使用酶聯(lián)免疫吸附法[S].

[15] ISO 14675：2003（IDF186：2003），牛奶和牛奶制品.競爭酶聯(lián)免疫分析的標(biāo)準(zhǔn)化描述指南.黃曲霉毒素M1含量的測定[S].

[16] 鄧省亮，賴衛(wèi)華，許暢.膠體金免疫層析法快速檢測AFTB1的研究[J].食品科學(xué)，2007，28（2）：232-235.

[17] 孫秀蘭，張銀志，湯 堅，等.金標(biāo)免疫層析試條檢測樣品中AFTB1的誤差分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2007，35（7）：188-192.

[18] NY 1664-2008，牛乳中黃曲霉毒素M1的測定[S].