影響牛胚胎移植妊娠率的主要因素分析

薛仰全

摘要：近年來(lái)隨著對(duì)影響胚胎移植妊娠率的胚胎質(zhì)量、供受體同期性、受體體況、受體年齡、營(yíng)養(yǎng)狀況、胚胎移植時(shí)間、移植部位和環(huán)境條件以及移植后受體的飼養(yǎng)管理等諸多因素的不斷深入研究，使該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于牛羊等動(dòng)物的良種快速擴(kuò)繁的生產(chǎn)中。就影響牛胚胎移植妊娠率的主要因素進(jìn)行了分析，以期為牛胚胎移植提供一定參考。

關(guān)鍵詞：牛；胚胎移植；妊娠率；因素

中圖分類號(hào)：S814.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1007-273X（2013）06-0074-04

自Georg首次提出動(dòng)物胚胎移植概念后，研究胚胎移植技術(shù)的歷史已經(jīng)有了120多年。近20多年以來(lái)，隨著胚胎移植技術(shù)中供受體選擇、直腸黃體檢查、同期發(fā)情、凍精授配、超數(shù)排卵、胚胎冷凍保存、胚胎解凍以及胚胎移植等關(guān)鍵環(huán)節(jié)技術(shù)，逐漸被眾多畜牧獸醫(yī)學(xué)者和科研技術(shù)人員所熟練掌握，特別是研究人員對(duì)影響胚胎移植妊娠率的胚胎質(zhì)量、供受體同期性、受體體況、受體年齡、營(yíng)養(yǎng)狀況、胚胎移植時(shí)間、移植部位和環(huán)境條件以及移植后受體的飼養(yǎng)管理等諸多因素的不斷深入研究。技術(shù)被廣泛應(yīng)用于牛、羊等動(dòng)物的良種快速擴(kuò)繁的生產(chǎn)中。目前，我國(guó)牛胚胎移植妊娠率一般在40%～60%，已達(dá)到世界同類高水平。但是，由于供受體不夠理想、胚胎價(jià)格奇高和胚胎移植產(chǎn)業(yè)機(jī)制尚未健全以及廣大農(nóng)牧戶收入偏低等因素的制約，在胚胎移植大面積推廣工作中仍存在較大的難度。

1 胚胎

胚胎質(zhì)量是胚胎移植妊娠率高低的決定因素。無(wú)論是體內(nèi)胚胎，還是體外胚胎，高質(zhì)量的胚胎，移植妊娠率就高。但就單一胚胎而言，胚胎的發(fā)育階段或胚胎日齡、胚胎冷凍技術(shù)和解凍方法等因素對(duì)胚胎移植妊娠率也具有明顯的影響。通常情況下，通過(guò)超數(shù)排卵所獲得的體內(nèi)胚胎的胚齡為6～10日齡。按胚胎的發(fā)育階段，將胚胎可分為桑椹胚（M）、早期囊胚（EB）、囊胚（MB）、擴(kuò)張囊胚（EXB）和孵化胚胎（HB）[1]。

Hasler等[2]認(rèn)為牛鮮胚移植時(shí)，囊胚的移植妊娠率高于桑椹胚；Thibier等[3]認(rèn)為囊胚的移植妊娠率與桑椹胚相似；Dochi等[4]認(rèn)為擴(kuò)張囊胚的移植妊娠率比桑椹胚低。根據(jù)研究資料，一般認(rèn)為超數(shù)排卵供體發(fā)情受精后6～8 d，獲得的優(yōu)質(zhì)胚胎移植妊娠率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但6～8 d的優(yōu)質(zhì)胚胎的移植妊娠率顯著高于發(fā)情后9～12 d從供體所獲得的優(yōu)質(zhì)胚胎的妊娠率，其移植妊娠率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Crosier等[5]認(rèn)為，胚胎質(zhì)量不同（A級(jí)到C級(jí)），其移植妊娠率顯著不同，早、晚期桑椹胚，和早、晚期囊胚的胚胎質(zhì)量明顯影響胚胎移植妊娠率。Leibo[6]研究發(fā)現(xiàn)凍胚移植妊娠率為40%～50%， 凍前A級(jí)或B級(jí)胚胎解凍后移植率為46%，C級(jí)胚胎的移植妊娠率為24%。Broadbent等[7]認(rèn)為凍胚與鮮胚移植相比，凍胚移植妊娠率低8.5%～14.0%，主要原因是由于冷凍對(duì)胚胎物理和化學(xué)性損害所引起。胚胎質(zhì)量、胚胎冷凍和解凍對(duì)胚胎的損傷，影響胚胎移植妊娠率。目前最理想的冷凍和解凍方法也將有10%～20%的胚胎受到傷害而死亡，死亡胚胎主要是質(zhì)量差的胚胎[1]。

體外受精（IVF或IVP）胚移植成功率低于體內(nèi)胚，但因其生產(chǎn)成本較低，多年來(lái)一直是主要的研究方向。由于不同生產(chǎn)方式生產(chǎn)的胚胎，其胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛能的不同，移植受胎率也就不同，因此生產(chǎn)高質(zhì)量的胚胎是提高胚胎移植妊娠率的最有效措施之一[8，9]。

2 供受體同期性

由于受精卵（胚胎）在子宮環(huán)境中生長(zhǎng)發(fā)育，其子宮內(nèi)分泌發(fā)生變化直接影響著子宮內(nèi)環(huán)境的變化，所以供體和受體在生理上的是否同一性直接影響著胚移妊娠率。胚胎移植某一發(fā)育階段的胚胎在供體子宮所處的生理環(huán)境或早或遲于移植受體的子宮生理環(huán)境，必然影響移植胚胎的著床，所以供體與受體的發(fā)情的同期化就影響著移植妊娠率。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)受體比供體發(fā)情早36 h時(shí)，胚胎移植妊娠率不受影響，原因目前尚不清楚，可能是由于超數(shù)排卵牛的胚胎發(fā)育比不超數(shù)排卵牛相對(duì)快所致[2]。當(dāng)受體比供體發(fā)情晚12 h以上時(shí)，胚胎移植妊娠率就下降[10]。水牛在胚胎移植中，受體比供體發(fā)情晚不到12 h時(shí)胚胎移植妊娠率為41%，相差12 h時(shí)胚胎移植妊娠率為18%，受體比供體發(fā)情晚的時(shí)間超過(guò)12 h時(shí)，胚胎不能著床[11]。

將質(zhì)量較差的胚胎移植到同期程度最佳的受體，將質(zhì)量好的胚胎移植到同期程度較差的受體內(nèi)，胚胎移植妊娠率最高[12]。將高質(zhì)量的胚胎移植到同期或比供體發(fā)情早的受體中時(shí)，妊娠率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者都高于比供體發(fā)情晚的受體移植妊娠率[11]。質(zhì)量較差的胚胎移植到比供體發(fā)情早的受體中時(shí)，胚胎移植妊娠率低于與供體同期發(fā)情的受體，但當(dāng)移植到比供體晚發(fā)情的受體時(shí)，胚胎移植妊娠率與前者沒(méi)有差異[1]。由于質(zhì)量較差的胚胎往往出現(xiàn)發(fā)育遲緩，可能移植到比供體晚發(fā)情的受體時(shí)，受體為胚胎提供了良好的子宮環(huán)境的緣故。所以，開(kāi)展胚胎移植要充分考慮供、受體發(fā)情的同期性和胚胎的質(zhì)量[1]。在進(jìn)行鮮胚移植時(shí)，肉牛比奶牛育成牛對(duì)供受體非同期性敏感，但有人認(rèn)為肉牛、奶牛育成牛對(duì)供受體非同期性沒(méi)有差異[13]。

3 受體

移植胚胎與受體之間無(wú)遺傳關(guān)系，但研究發(fā)現(xiàn)受體的年齡、營(yíng)養(yǎng)狀況、同期發(fā)情處理方法、孕酮水平和黃體質(zhì)量等因素對(duì)受體胚胎移植妊娠率有著明顯的影響。

3.1 年齡與營(yíng)養(yǎng)

在農(nóng)牧區(qū)進(jìn)行移植胚胎，受體選用體況較好、無(wú)繁殖疾病、體格健壯、抗病性良好、性格溫順、哺育仔畜能力強(qiáng)的經(jīng)產(chǎn)土種牛。但年齡過(guò)大的受體牛，因繁殖能力降低、生殖器官易出現(xiàn)不易觀察到的疾病等問(wèn)題，對(duì)移植效果會(huì)有一定的影響。青年牛的胚胎移植效果要好于成年牛，但通過(guò)子宮頸的難度要高于經(jīng)產(chǎn)成年牛；青年牛會(huì)因個(gè)體差異會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)，難產(chǎn)率也較高[14]。對(duì)于受體來(lái)講，營(yíng)養(yǎng)對(duì)其繁殖性能都具有慢性和長(zhǎng)期性的影響作用。受體牛不但要供給自身的維持需要，還要供給胚胎發(fā)育的生長(zhǎng)需要，從而就產(chǎn)生了受體營(yíng)養(yǎng)影響胚胎妊娠率的問(wèn)題。受體牛短期營(yíng)養(yǎng)不足，可通過(guò)動(dòng)用自身儲(chǔ)備的營(yíng)養(yǎng)來(lái)補(bǔ)充，一般對(duì)胚胎移植妊娠率沒(méi)有影響[15]，如果其他營(yíng)養(yǎng)不充分時(shí)，礦物質(zhì)、微量元素和維生素顯得特別重要，它將對(duì)母體的繁殖產(chǎn)生長(zhǎng)遠(yuǎn)的影響[16]。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化會(huì)影響瘤胃的發(fā)酵，隨之影響物質(zhì)的代謝和內(nèi)分泌，因此日糧的選擇和相對(duì)穩(wěn)定與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量對(duì)受體來(lái)說(shuō)具有同樣重要的作用[17]。研究表明，受體移植前至少6周確定日糧標(biāo)準(zhǔn)，并維持統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)日糧8周以上，如果日糧必須變化時(shí)，也要逐步進(jìn)行[10]。

3.2 同期發(fā)情方案

Hasler等[2]認(rèn)為用前列腺素（PG）處理的受體胚胎移植妊娠率高于自然發(fā)情； Looney等[18]認(rèn)為用前列腺素（PG）處理的受體胚胎移植妊娠率與自然發(fā)情兩者之間沒(méi)有差別；Church等[19]認(rèn)為前列腺素（PG）處理的胚胎移植妊娠率低于自然發(fā)情。MacMillan等[20]認(rèn)為孕酮處理可提高受體的同期發(fā)情率，但長(zhǎng)時(shí)間使用時(shí)（>12 d）降低妊娠率。進(jìn)口的PRID和CIDR以及國(guó)產(chǎn)的海棉陰道栓"牛歡"等都是通過(guò)陰道緩慢釋放孕酮的裝置，胚胎移植實(shí)踐證明，還存在著脫落和對(duì)育成牛陰道壁容易損傷和不適等副作用[1]。

不同的同期發(fā)情方案，對(duì)受體牛同期發(fā)情率的影響是不同的。即使是同一發(fā)情方案，對(duì)不同品種牛的同期發(fā)情率的影響也是不同的。對(duì)于同期發(fā)情方案不能照抄照搬，要根據(jù)本區(qū)域不品種牛的生長(zhǎng)特征、體況營(yíng)養(yǎng)以及農(nóng)牧戶的經(jīng)濟(jì)承受能力，通過(guò)研究篩選出同期發(fā)情率高、經(jīng)濟(jì)成本低、省工省時(shí)、便于操作的發(fā)情方案是科學(xué)的做法。

3.3 孕酮水平

孕酮是決定子宮生理狀態(tài)的主要甾類激素之一，是母體建立和維持妊娠所必需的物質(zhì)[15]。牛妊娠時(shí)外周血液中孕酮的適宜含量為2.0～5.0 ng/mL， 最低限為<0.5 ng/mL[21]。許多動(dòng)物品種配種后通過(guò)追加孕酮可提高胚胎的存活率[1]。Christie等[22]認(rèn)為牛胚胎移植后13～35 d每天注射100 mg孕酮對(duì)胚胎存活率沒(méi)有影響，注射HCG誘導(dǎo)附加黃體和提高外周孕酮含量對(duì)妊娠率和胚胎存活率也沒(méi)有。

3.4 黃體質(zhì)量

Hasler等[2]認(rèn)為胚胎移植妊娠率與黃體的質(zhì)量無(wú)關(guān)，充滿液體的黃體可能是黃體囊腫或早期胚胎死亡的一個(gè)可能的原因[23]，后來(lái)研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)充滿液體的黃體和無(wú)液體的黃體牛妊娠率的差異[22]。另外，在受體外周血液孕酮含量方面也沒(méi)有差異。通過(guò)超聲波技術(shù)觀察黃體的大小也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)多大的黃體是受體牛妊娠率下降的界限[24]。

4 技術(shù)操作

胚胎移植技術(shù)操作對(duì)移植妊娠率的影響主要表現(xiàn)為操作人員的技術(shù)熟練程度、胚胎解凍與脫除防凍劑的方法、通過(guò)子宮頸的技巧、胚胎移植所用的時(shí)間、移植部位等。理論上認(rèn)為，將胚胎移植于有孕向發(fā)育子宮的任何一側(cè)均能正常妊娠，但是由于受黃體激素分泌因素的影響，以黃體側(cè)移植時(shí)能獲得較高的妊娠率。胚胎移植器無(wú)損傷的順利通過(guò)子宮頸，移植妊娠率一般均較高[25]。但對(duì)于因子宮畸形或器質(zhì)性原因造成的子宮頸難以通過(guò)的受體牛，即使通過(guò)器械擴(kuò)張免強(qiáng)通過(guò)，也會(huì)因出血以及牛體應(yīng)激過(guò)大等因素的影響，很難取得理想的妊娠效果。早期手術(shù)移植時(shí)，一般很容易將胚胎移植于子宮角深部甚至尖端，而非手術(shù)移植時(shí)也同樣是移植位置越深越能得到較好的妊娠率。但是由于受到移植人員自身素質(zhì)等因素的限制，若勉強(qiáng)移植于子宮角深部，勢(shì)必會(huì)損傷子宮黏膜，其最終的結(jié)果可能會(huì)因胚胎被血液凝固或移植時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等造成妊娠率更低。生產(chǎn)中，熟練技術(shù)人員移植受胎率可高達(dá)78.4%[26]。

羅明玖等[27]認(rèn)為胚胎移植人員移植手法要穩(wěn)、輕、快，可使子宮頸受刺激盡可能減少，同時(shí)防止子宮平滑肌產(chǎn)生不利的逆蠕動(dòng)，進(jìn)而影響體內(nèi)生殖激素的變化，引起不適宜懷孕的反應(yīng)。李樹(shù)靜等[28]、馬群山等[29]還認(rèn)為手法的輕柔對(duì)子宮頸、子宮會(huì)造成損傷，一旦內(nèi)膜損傷，上皮細(xì)胞就會(huì)脫落，甚至有出血發(fā)生，上皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、白細(xì)胞等進(jìn)入宮腔，反射性引起子宮自凈功能活動(dòng)將會(huì)增強(qiáng)，使胚胎會(huì)同組織碎片、各種細(xì)胞等一起被排除子宮進(jìn)入到宮腔內(nèi)的血液中，由于血液的活性作用對(duì)胚胎造成毒害，因而受胎率就大大降低。馬群山等[29]、Hillier等[30]等認(rèn)為若將胚胎自液氮中取出后，直接放入35～38℃的恒溫水浴中進(jìn)行解凍，胚胎易出現(xiàn)透明帶破裂現(xiàn)象。在放入水浴中前要在室溫中停留3～4 s，效果較好。何光中等[31]報(bào)道左側(cè)、右側(cè)卵巢的黃體移植妊娠率有差異，右側(cè)大于左側(cè)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而付靜濤[32]報(bào)道左側(cè)黃體受胎率高于右側(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。張震等[26]認(rèn)為胚胎移植所用時(shí)間長(zhǎng)短也是影響妊娠率的一個(gè)關(guān)鍵因素。特別是冷凍胚胎的移植，操作時(shí)間長(zhǎng)則妊娠率下降，短則有利于提高妊娠率。新鮮胚在1～2 h（保存在37 ℃恒溫環(huán)境下）內(nèi)移植，凍胚在5～7 min以內(nèi)移植，均能夠取得較為良好的妊娠率[33]。因此，在非手術(shù)移植時(shí)，在短的時(shí)間內(nèi)，迅速、熟練、輕巧地將胚胎移植到子宮角的中間位置，也是提高妊娠率的措施之一。同樣，在胚胎移植工作中除需熟練進(jìn)行胚胎室內(nèi)操作的專業(yè)人員外，也不可缺少的需要掌握過(guò)硬本領(lǐng)的胚胎移植技術(shù)人員（或人工授精技術(shù)人員）[34]。

5 飼養(yǎng)管理

移植后受體牛的飼養(yǎng)管理對(duì)胚胎移植成功率的特殊作用的研究很少見(jiàn)報(bào)道。但從胚胎移植工作的整體來(lái)看，胚胎移植前期各項(xiàng)工作的成功僅是完成了胚胎移植的一部分，而移植后受體牛的飼養(yǎng)管理工作絕不能忽視。李樹(shù)靜等[35]在大型奶牛場(chǎng)用黑白花奶牛做受體，移植妊娠率顯著高于草原放牧條件下受體牛的移植妊娠率。該研究表明，胚胎移植后受體牛飼養(yǎng)管理水平的好壞，也對(duì)移植妊娠率有影響作用。胚胎移植受體牛飼養(yǎng)管理經(jīng)驗(yàn)表明，在胚胎著床前期，要更加重視和加強(qiáng)受體牛的飼養(yǎng)管理，特別要注意不能飼喂發(fā)霉變性、有毒的飼料，也不能飲用冰冷的水；移植胚胎后要適時(shí)檢查妊娠情況，并及時(shí)剔除未妊娠牛群，盡可能將受體牛與育成牛分開(kāi)飼喂，避免不必要的相互爬跨，防止各種意外造成受體牛的流產(chǎn)。

6 氣候因素

氣候是一個(gè)寬泛的綜合因素，以溫度的高低、天氣的冷暖、大氣的干濕等特征來(lái)表現(xiàn)。它對(duì)胚胎移植妊娠率的影響，是通過(guò)氣候環(huán)境變化影響胚移受體牛所處環(huán)境（或其他因素）因素的變化，對(duì)受體牛產(chǎn)生的應(yīng)激刺激而作用的。

環(huán)境高溫導(dǎo)致母牛乏情或發(fā)情不排卵和妊娠率降低[35]。殷宗俊等[36]認(rèn)為胚胎移植選在每年的春季和秋季為最好，在這兩個(gè)時(shí)期來(lái)自外界的各種強(qiáng)應(yīng)激因素較少，氣候適宜，牛群飼料來(lái)源廣泛，營(yíng)養(yǎng)有利于調(diào)控，各方面因素都有利于妊娠率的提高。馬群山等[29]研究認(rèn)為因解凍后的胚胎一般要在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行移植，而我國(guó)北方地區(qū)10月末到4月末氣溫較低，15 ℃以下的溫度，將對(duì)胚胎造成低溫打擊，在7～8月份氣溫較高，母牛的代謝等發(fā)生變化，胚胎移植的死亡率相應(yīng)增加，在我國(guó)北方地區(qū)最適宜進(jìn)行胚胎移植的季節(jié)為5～6月和9～10月份[29]。

7 其他因素

胚胎移植時(shí)所用的儀器設(shè)備、通過(guò)受體牛子宮的難易程度、受體牛耐受各種刺激的敏感性以及供選擇受體數(shù)量的多少等人們難以考慮其他因素也會(huì)影響胚胎移植妊娠率，只不過(guò)每一因素影響的程度不同而已。

綜上所述，牛胚胎移植妊娠率的高低受多種因素的影響，在生產(chǎn)中要全面綜合考慮各種影響因素，按胚胎移植規(guī)程仔細(xì)操作，才能獲得比較滿意的結(jié)果。

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