蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348菌株防治番茄灰霉病的效果及機(jī)理研究

唐容容 楊文革 胡永紅 江心敏 劉郵洲 章泳

摘要：試驗(yàn)研究蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）CGMCC4348菌株對(duì)番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）的生物防治效果，并初步探討其抑菌機(jī)理，以尋找防治番茄灰霉病的新方法。試驗(yàn)從定量生物測(cè)定、室內(nèi)離體抑菌試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)3個(gè)方面考察其抑菌作用效果，并以硫酸銨分級(jí)沉淀法提取拮抗蛋白進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，室內(nèi)抑菌試驗(yàn)的EC50為6.19 mg/L；盆栽試驗(yàn)中處理3對(duì)番茄灰霉病的平均防效達(dá)75.80%，與50 mg/L嘧霉胺處理的防效相當(dāng)。試驗(yàn)證明蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348對(duì)番茄灰霉病菌有較好防治效果。

關(guān)鍵詞：蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）；番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）；生物防治；CGMCC4348

中圖分類號(hào)：S436.3；S476.19 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）08-1817-04

灰霉病可侵染200多種植物的花、果實(shí)及其他綠色組織[1，2]，導(dǎo)致組織腐爛，喪失利用價(jià)值。近年來中國(guó)蔬菜灰霉病發(fā)生面積逐年增加，成為蔬菜生產(chǎn)的一大障礙[3]。其中茄科蔬菜以番茄受害最重，一般發(fā)病田塊番茄灰霉病造成的產(chǎn)量損失為20%～40%，重病田塊達(dá)60%以上[4]。

長(zhǎng)期以來生產(chǎn)上主要依靠化學(xué)農(nóng)藥防治灰霉病，病原菌對(duì)常用化學(xué)藥劑極易產(chǎn)生抗藥性，且長(zhǎng)期依賴和大量使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)帶來環(huán)境污染和食品安全等問題[5-7]。多種真菌、細(xì)菌對(duì)灰霉病菌均有一定的抑制作用[8]，如木霉、粘帚霉、酵母菌、假單胞桿菌等，近年利用生防菌成為植物灰霉病防治的新策略。作者在番茄病害生物防治研究中篩選到1株可有效抑制番茄灰霉病菌（灰葡萄孢菌，Botrytis cinerea）的生防菌株，經(jīng)鑒定為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），命名為CGMCC4348[9，10]。本研究以室內(nèi)抑菌試驗(yàn)與盆栽防效試驗(yàn)結(jié)合的方式來探討該生防菌對(duì)灰霉病的防治效果，并提取有效拮抗蛋白進(jìn)一步探索其抑菌機(jī)理，以期為設(shè)施茄果類蔬菜病害綠色防控技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

生防菌：蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348，南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離和保存，發(fā)酵培養(yǎng)基為YPG培養(yǎng)液[11]，菌種活化與保存采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[12]。

番茄灰霉病病原菌：灰葡萄孢菌，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物防治實(shí)驗(yàn)室分離和保存，采用PDA培養(yǎng)基[13]培養(yǎng)。

1.2 定量生物測(cè)定

將番茄灰霉病菌在PDA平板上活化，25 ℃培養(yǎng)待用；活化后的蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348于YPG培養(yǎng)液中28 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)36 h。

定量生物測(cè)定采用平板對(duì)峙法，將蠟樣芽孢桿菌菌液稀釋成不同的濃度梯度，每濃度處理重復(fù)5次，以無菌液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率[14]。數(shù)據(jù)處理采用DPS軟件[15]，建立濃度對(duì)數(shù)—抑制百分率機(jī)率值毒力回歸方程式，計(jì)算抑制中濃度（EC50）。

1.3 離體抑菌試驗(yàn)

取新鮮番茄苗第三、第四片真葉，用無菌水洗凈，置于裝有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，打孔器打取灰霉菌菌餅，無菌條件下接于葉片之上。對(duì)照，只接灰霉病菌；處理1，接入灰霉病菌36 h后以噴霧方式接入1 mL生防菌發(fā)酵液；處理2，噴霧接入1 mL生防菌發(fā)酵液后接入生防菌，24 h后接入灰霉病菌。每處理重復(fù)5次。培養(yǎng)皿置于人工氣候箱中，溫度28 ℃，光照12 h/d，相對(duì)濕度60%。70 h后觀察抑菌效果。

1.4 盆栽防效試驗(yàn)

將無菌條件下萌發(fā)的番茄種子（品種為日本美玉）播于土壤（自然土∶營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石為5∶4∶1）中，溫室育苗，當(dāng)番茄苗長(zhǎng)出4片真葉時(shí)盆缽單株移栽。以無菌水洗下番茄灰霉病菌分生孢子，制成4×106個(gè)孢子/mL濃度的灰霉孢子懸浮液，以噴霧的方式均勻接種于番茄葉部10 mL，灌根10 mL。生防菌稀釋至1×106 CFU/mL，以噴霧方式接種10 mL于葉片上。各處理如下：對(duì)照，只接種灰霉孢子液，后續(xù)清水處理；處理1，同時(shí)進(jìn)行灰霉孢子液和生防菌液處理；處理2，灰霉孢子液處理 2 d后，接種生防菌液；處理3，生防菌液連續(xù)處理2 d后，接種灰霉孢子液；處理4，灰霉孢子液處理后噴霧50 mg/L嘧霉胺10 mL。每處理60盆，溫室培養(yǎng)。溫室溫度20～25 ℃、相對(duì)濕度80%～90%。采用文獻(xiàn)[16]方法統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)及防效。病情分級(jí)的根據(jù)是葉片病斑面積占整個(gè)葉面積的百分比，0級(jí)，無病斑；1級(jí)，≤5%；3級(jí)，5%～10%；5級(jí)，10%～20%；7級(jí)，20%～50%；9級(jí)，≥50%。

1.5 抑菌作用機(jī)理試驗(yàn)

1.5.1 拮抗蛋白的提取 蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵液4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取離心上清液在室溫下加入硫酸銨，使其飽和度達(dá)室溫下的20%，充分?jǐn)嚢?0 min后，于4 ℃、1 2000 r/min離心20 min，收集第一級(jí)沉淀物和第一級(jí)上清液。將第一級(jí)上清液以15%飽和度為梯度，繼續(xù)加入硫酸銨充分?jǐn)嚢?，重?fù)上述步驟，收集不同組分的上清液與沉淀。第一、第二、第三、第四級(jí)沉淀組分分別記為A、B、C、D。沉淀組分用PBS溶解并透析[17]，得到抗菌蛋白提取液。

1.5.2 發(fā)酵液不同組分抑菌效果研究 各組分進(jìn)行平板對(duì)峙試驗(yàn)。處理1，蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵液；處理2，發(fā)酵液4 ℃、8 000 r/min離心10 min得到的上清液；處理3，相同離心方法得到的不同稀釋梯度沉淀；處理4，硫酸銨分級(jí)沉淀得到的蛋白組分A、B、C、D；處理5，去除蛋白組分后的上清液組分，以無菌水處理作為對(duì)照。每處理重復(fù)5次。

2 結(jié)果與分析

2.1 定量生物測(cè)定結(jié)果

平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度梯度的蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348對(duì)番茄灰霉病菌菌絲的生長(zhǎng)表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，生防菌菌液直接處理的抑菌圈直徑為2.9 cm，抑制率達(dá)72.90%，效果最為明顯。利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)得到毒力回歸方程及抑制中濃度（表1），其EC50為6.19 mg/L，95%置信區(qū)間為0.563 5～25.678 3，模型相關(guān)性良好。從相對(duì)毒力指數(shù)可以看出該生防菌毒力高于灰霉病常用防治藥劑嘧霉胺。

2.2 離體抑菌試驗(yàn)結(jié)果

蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348室內(nèi)離體抑菌試驗(yàn)結(jié)果見圖1。從圖1可見，蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348對(duì)番茄灰霉病有極好的防治效果。對(duì)照組番茄葉片發(fā)病嚴(yán)重，病原菌菌絲茁壯，病部表面產(chǎn)生濃密灰色霉層，凡菌絲觸及的地方葉片腐爛。與對(duì)照組相比，處理1葉片上出現(xiàn)較小水漬狀病斑，無菌絲生長(zhǎng)，生防菌對(duì)灰霉病的發(fā)生和蔓延起到了有效的控制作用。處理2中灰霉菌菌絲明顯萎縮，葉片均未發(fā)病，表明該生防菌不僅對(duì)菌絲生長(zhǎng)有極強(qiáng)的抑制作用，還可提高葉片對(duì)灰霉病的抗性，保證葉片不發(fā)病。

2.3 盆栽試驗(yàn)中蠟樣芽孢桿菌防治番茄灰霉病效果

盆栽試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示：處理3即生防菌液處理2 d后接入灰霉孢子液防治效果最好，防效為75.80%，與50 mg/L嘧霉胺處理組的防效相當(dāng)。嘧霉胺是常用的灰霉病防治農(nóng)藥，但在應(yīng)用于防治番茄灰霉病過程中病原菌會(huì)對(duì)其逐漸產(chǎn)生抗性，實(shí)用性降低，從試驗(yàn)看，效果不如蠟樣芽孢桿菌。處理3的防治效果優(yōu)于處理2，是因?yàn)樘崆皩?duì)番茄苗接入蠟樣芽孢桿菌菌液，提高了植物的抗性，在等量病原菌處理情況下其發(fā)病率更低。Benhamou等[18]、夏立秋[19]的研究也發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌可通過誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性來發(fā)揮生防作用。蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348提高番茄植株對(duì)灰霉病抗性的機(jī)理有待后續(xù)研究。

2.4 蠟樣芽孢桿菌對(duì)番茄灰霉病病原菌的抑制作用機(jī)理

在平板對(duì)峙試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，生防菌菌落周圍有明顯的抑菌圈（圖2），說明蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348的拮抗作用與胞外分泌的拮抗物質(zhì)有關(guān)。通過對(duì)番茄灰霉病病原菌的抑制作用機(jī)理試驗(yàn)結(jié)果（表3）可看出，硫酸銨沉淀法提取出的二級(jí)蛋白組分B拮抗作用最強(qiáng)，抑制率為68.81%，接近于發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制率。說明發(fā)酵液中存在對(duì)番茄灰霉病具有很強(qiáng)抑制作用的拮抗蛋白。除蛋白后的發(fā)酵液上清液組分對(duì)灰霉菌無抑制效果，說明生防菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)主要為胞外蛋白。發(fā)酵液離心后的沉淀主要是菌體，其抑菌效果不明顯，抑制率遠(yuǎn)低于上清液的55.25%，推測(cè)是離心造成菌體裂解，使其活性下降，但該試驗(yàn)結(jié)果不能完全說明菌體對(duì)病原菌無抑制作用。在大田環(huán)境中，菌體能與病原菌在植物葉片或根、莖上進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)等生存環(huán)境競(jìng)爭(zhēng)，以定殖方式產(chǎn)生穩(wěn)定的拮抗作用。大田實(shí)際效果有待后續(xù)工作中進(jìn)行深入研究。

3 小結(jié)與討論

灰霉病是一種嚴(yán)重危害番茄品質(zhì)和產(chǎn)量的真菌病害，利用具有生防作用的芽孢桿菌屬菌株來防治此類真菌性病害是近年科研工作者研究的熱點(diǎn)之一，其中應(yīng)用較多的是枯草芽孢桿菌。研究和開發(fā)其他芽孢桿菌，增加生防菌在防治過程中的生態(tài)多樣性，對(duì)生物防治更為有利。試驗(yàn)首次采用具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348進(jìn)行定量生物測(cè)定、離體抑菌試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)此菌株對(duì)番茄灰霉病病原菌有良好的抑制作用。室內(nèi)抑菌試驗(yàn)同時(shí)表明該生防菌能分泌抗真菌的拮抗物質(zhì)，并對(duì)病原菌起主要抑制作用。試驗(yàn)初步提取出具有拮抗作用的蛋白組分，在后續(xù)研究中對(duì)蛋白組分進(jìn)行進(jìn)一步純化，并對(duì)其結(jié)構(gòu)與生理生化特性進(jìn)行深入研究，將對(duì)探索生防菌控制植物真菌病害效果的提高和穩(wěn)定具有重要的理論與實(shí)踐價(jià)值。室內(nèi)抑菌試驗(yàn)與盆栽試驗(yàn)中生防菌防效與嘧霉胺相當(dāng)，甚至優(yōu)于嘧霉胺處理組，在此基礎(chǔ)之上，后續(xù)將進(jìn)行田間防效試驗(yàn)，并對(duì)此菌株進(jìn)行標(biāo)記以研究其定殖機(jī)理，為研制新型高效的生物農(nóng)藥提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] MOJUMDAR S C， HUDECOVA D，MELNIK M. Preparation， spectral properties and antimicrobial effects of new Cu（II） compounds with some bio-active ligands[J]. Polish Journal of Chemistry，1999，73（5）：759-764.

[2] OLIVAIN C，ALABOUVETTE C. Process of tomato root colonization by a pathogenic strain of Fusarium oxysporum fsp. lycopersici in comparison to a non-pathogenic strain[J].New Phytologist，1999，141（3）：497-510.

[3] 唐麗娟，紀(jì)兆林，徐敬友，等.地衣芽孢桿菌W10對(duì)灰葡萄孢的抑制作用及其抗菌物質(zhì)[J]. 中國(guó)生物防治，2005，21（3）：203-205.

[4] 陳利鋒，徐敬友.農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007.

[5] LIANG J H， TANG S Y， CHEKE R A. An integrated pest management model with delayed responses to pesticide applications and its threshold dynamics[J]. Nonllnear Analysis World Applications，2012，13（5）：2352-2374.

[6] GILBERT-LOPEZ B，JAEN-MARTOS L，GARCIA-REYES J F， et al. Study on the occurrence of pesticide residues in fruit-based soft drinks from the EU market and morocco using liquid chromatography mass spectrometry[J]. Food Control，2012， 26（2）：341-346.

[8] 朱宏建，易圖永，周鑫鈺.土壤放線菌生防活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].作物研究，2007，21（2）：149-151.

[9] 管 珺，楊文革，王瑞榮，等. Bacillus cereus CMCC63305的促生、抑菌及殺蟲作用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（1）：228-230.

[10] 管 珺，胡永紅，楊文革，等.蠟樣芽孢桿菌防治植物病蟲害的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)藥，2007，6（4）：7-10.

[11] 孫正祥，王振中.生防細(xì)菌C-4的特性鑒定及其對(duì)香蕉枯萎病的防治效果[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2009，36（5）：392-396.

[12] 馬 越，特玉香，戴 紅，等.PYA與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基細(xì)菌計(jì)數(shù)比較[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2006，7（2）：87-89.

[13] 華寶玉，林 娟，嚴(yán) 芬，等.產(chǎn)果膠酶菌株的鑒定及其產(chǎn)酶條件的研究[J].福州大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，40（3）：412-417.

[14] RUBIO M B， CARDOZA R E， HERMOSA R， et al. Cloning and characterization of the thcutl gene encoding a cutinase of Trichoderma harzianum T34[J]. Curr Genet，2008，54（6）：301-312.

[15] 常有宏，劉郵洲，王 宏，等.嘧霉胺與枯草芽孢桿菌B-916協(xié)同防治梨黑斑病[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，26（2）：1227-1232.

[16] 方中達(dá).植病研究方法[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[17] 胡永紅，楊文革，王瑞榮，等.一種從蠟樣芽孢桿菌高密度發(fā)酵液中提取蛋白質(zhì)的方法[P].中國(guó)專利：201210056365.7，2012-10-03.

[18] BENHAMOU N，KLOEPPER J W， TUZUN S. Induction of resistance against Fusarium wilt of tomato by combination of chintosan with an endophytic bacterial strain： Ultrastructure and cytochemistry of the host response[J]. Planta，1998，204（2）：153-168.

[19] 夏立秋.增產(chǎn)菌的作用機(jī)制研究——增產(chǎn)菌超氧化物歧化酶的純化及性質(zhì)研究[J]. 農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究，1992，13（2）：106-109.