法舒地爾對腹膜透析大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響

長期腹膜透析(PD)可使腹膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，包括腹膜間皮細(xì)胞脫落、腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)及腹膜纖維化[1,2]。它可引起腹膜功能減退，超濾失敗，最終導(dǎo)致PD失敗。大量研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)在PD相關(guān)性腹膜EMT和纖維化中起著至關(guān)重要的作用[3-5]。

Rho激酶(Rho-kinase)是Rho蛋白下游效應(yīng)器，可磷酸化其下游靶點,如肌球蛋白輕鏈和肌球蛋白輕鏈磷酸酯酶(MYPT1)。Rho/Rho-kinase對許多細(xì)胞活動(如血管平滑肌細(xì)胞收縮、肌動蛋白細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞黏附和移動、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞增生和基因表達(dá)等)具有重要的調(diào)節(jié)作用[6]。有研究提示Rho kinase可通過調(diào)控TGF-β1通路在細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及組織纖維化中起非常重要的作用，Rho-kinase抑制劑可下調(diào)腎臟TGF-β1表達(dá)，從而減輕腎臟α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及腎纖維化的發(fā)生[6-9]。

Rho-kinase在PD相關(guān)腹膜EMT及纖維化中的作用尚無報道。因此,本研究旨在探討通過使用Rho-kinase抑制劑法舒地爾阻斷Rho/Rho-kinase信號通路是否能防治PD引起的腹膜EMT及腹膜纖維化,并為臨床防治提供實驗依據(jù)。

材料與方法

材料

實驗動物 雄性SD大鼠(二級，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供)，體重180～200g。

主要試劑 4.25％葡萄糖透析液購于Baxter公司；驢抗兔FITC；碘化丙啶(DAPI)購于Sigma公司；Trizol購于Invitrogen公司；法舒地爾購于Sigma公司；MYPT1購于Sigma公司；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體購于santa cruz公司；小鼠抗大鼠α-SMA多克隆抗體購于DAKO公司；兔抗大鼠E鈣黏蛋白(E-cadherin)多克隆抗體購于santa cruz公司。

方法

分組 24只二級SD大鼠隨機(jī)分為4組：正常組6只；PD模型組6只，每天腹腔灌注4.25％葡萄糖透析液[按100 ml/(kg·BW)計算]；法舒地爾5 mg組(Fas 5 mg組， 6只)，每天腹腔灌注4.25％葡萄糖透析液及法舒地爾5 mg/(kg·d)；法舒地爾10 mg組(Fas 10 mg組， 6只)，每天腹腔灌注4.25％葡萄糖透析液及法舒地爾10 mg/(kg·d)。連續(xù)4周，于第4周行腹膜功能試驗后處死大鼠，分別留取腹膜臟、壁層組織于4°PLP液中固定9 h。同時留取腹膜臟層組織，置-80℃冰箱保存。

腹膜功能試驗 各組大鼠于第4周行腹膜功能試驗，試驗前48h停止PD。用10％水合氯醛麻醉大鼠，然后腹腔注射25 ml 4.25％透析液，4h后沿腹部正中切口打開腹腔，準(zhǔn)確量取腹腔液體。計算每只大鼠的超濾量。

超濾量=(最后出水量-25)ml

Western Blot檢測腹膜組織Rho-kinase活性 采用MYPT1為抗體檢測Rho-kinase活性。取200 mg臟層腹膜組織，碾碎后加入0.4 ml的細(xì)胞裂解液超聲粉碎， 4℃，15 000 r/min離心15 min，取上清測蛋白質(zhì)濃度。取相同質(zhì)量的蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用5％的脫脂奶粉室溫封閉1h，分別加入磷酸化MYPT1及MYPT1抗體(Rho激酶底物)，4℃過夜，TBST洗膜后用HRP標(biāo)記的IgG室溫孵育1h，洗膜后顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析。

免疫熒光檢查 免疫熒光檢測臟層腹膜TGF-β1、α-SMA、E-cadherin表達(dá)。PLP固定石醋包埋的組織切片經(jīng)二甲苯、乙醇脫醋脫水，用枸櫞酸鈉緩沖液微波修復(fù)抗原，5％BSA于37℃封閉30 min，分別加入TGF-β1、α-SMA、E-cadherin一抗4℃過夜后，加FITC標(biāo)記的二抗于37℃孵育1 h，然后用DAPI染核，緩沖甘油封片，最后用激光共聚焦顯微鏡觀察，隨機(jī)觀察10個視野，以單位面積的熒光強(qiáng)度為單位進(jìn)行熒光半定量分析。

Western Blot檢測腹膜組織蛋白表達(dá) 取200 mg腹膜組織，碾碎后加入0.4 ml的細(xì)胞裂解液超聲粉碎， 4℃，15 000 r/min離心15 min，取上清測蛋白質(zhì)濃度。取相同質(zhì)量的蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用5％的脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入兔抗大鼠TGF-β1、小鼠抗大鼠α-SMA、兔抗大鼠E-cadherin，及GAPDH抗體，4℃過夜，TBST洗膜后用HRP標(biāo)記的抗兔、小鼠IgG室溫孵育1 h，洗膜后顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析。

RT-PCR檢測腹膜臟層mRNA表達(dá) 用RT-PCR方法檢測臟層腹膜TGF-β1、α-SMA和E-cadherin mRNA的表達(dá)。引物序列從Genebank中查閱，根據(jù)引物設(shè)計原則，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計。序列分別為：GAPDH (725 bp) 上游：5’-G￣G￣C￣A￣A￣G￣T￣T￣C￣A￣A￣T￣G￣G￣C￣A￣C￣A￣G￣T-3’，下游：5’-A￣A￣G￣G￣T￣G￣G￣A￣G￣G￣A￣A￣T￣G￣G￣G￣A￣G￣T￣T-3’；TGF-β1 (432 bp)上游：5’-C￣T￣G￣T￣C￣C￣A￣A￣A￣C￣T￣A￣A￣G￣G￣C￣T￣C￣G￣C-3’,下游：5’-A￣G￣A￣C￣A￣G￣C￣C￣A￣C￣T￣C￣A￣G￣G￣C￣G￣T￣A-3’；E-cadherin(354 bp) 上游：5’-C￣A￣G￣G￣A￣T￣T￣A￣C￣A￣A￣G￣T￣T￣C￣C￣C￣G￣C￣C￣A-3’，下游：5’-C￣A￣C￣T￣G￣T￣C￣C￣G￣C￣T￣G￣C￣C￣T￣T￣C￣A￣G-3’；α-SMA(558 bp)上游：5’-G￣C￣T￣C￣T￣G￣T￣A￣A￣G￣G￣C￣G￣G￣G￣C￣T￣T￣T￣G-3’。下游：5’-A￣C￣G￣A￣A￣G￣G￣A￣A￣T￣A￣G￣C￣C￣A￣C￣G￣C￣T￣C￣A-3’。

采用Trizol一步法提取腹膜組織的RNA。cDNA的合成(逆轉(zhuǎn)錄)參照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序進(jìn)行。反應(yīng)體系50 μl，反應(yīng)條件：94℃ 3 min預(yù)變性，94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 45s，共33～35個循環(huán)，72℃延伸10 min。反應(yīng)后取5ul PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。應(yīng)用凝膠成像及圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

統(tǒng)計方法采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料用算術(shù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，兩組以上均數(shù)比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.01為統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

結(jié) 果

腹膜組織Rho-kinase活性首先采用Western blot方法檢測腹膜組織Rho-kinase活性，分別檢測磷酸化MYPT和總MYPT。如圖1所示，與正常組大鼠比較，PD大鼠腹膜組織Rho-kinase活性顯著增加，而法舒地爾呈劑量依賴模式降低Rho-kinase活性。Fas 10 mg組抑制Rho-kinase活性作用明顯優(yōu)于Fas 5 mg組(P<0.05)。

圖1 磷酸化pMYPT/總MYPT光密度標(biāo)準(zhǔn)化比值

法舒地爾對腹膜功能的影響如圖2所示，與正常組大鼠比較，PD大鼠腹膜超濾量顯著減少，腹膜功能明顯下降。而法舒地爾呈劑量依賴模式增加PD大鼠超濾量、改善腹膜功能，F(xiàn)as 10 mg組改善腹膜功能作用明顯強(qiáng)于Fas 5 mg組(P<0.05)。

圖2 法舒地爾抑制腹膜超濾量喪失

法舒地爾對腹膜組織TGF-β1蛋白及基因表達(dá)的影響免疫熒光、Western Blot和RT-PCR顯示，與正常組大鼠比較，PD大鼠腹膜組織TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01);而與PD模型組比較，法舒地爾呈劑量依賴模式下調(diào)PD大鼠腹膜組織TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)，F(xiàn)as 10 mg組比Fas 5 mg組下調(diào)更明顯(P<0.05)(圖3)。

法舒地爾對腹膜組織α-SMA、E-cadherin蛋白及基因表達(dá)的影響我們同時檢測腹膜組織轉(zhuǎn)分化指標(biāo)α-SMA、E-cadherin蛋白及基因的表達(dá)。免疫熒光、Western Blot和RT-PCR顯示，與正常組大鼠比較，PD大鼠腹膜組織α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01);而法舒地爾呈劑量依賴模式下調(diào)PD大鼠腹膜組織α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)，F(xiàn)as 10 mg組比Fas 5 mg組下調(diào)更明顯(P<0.05)(圖4)。

免疫熒光、Western Blot和RT-PCR顯示，與正常組大鼠比較，PD大鼠腹膜組織E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01);而法舒地爾呈劑量依賴模式上調(diào)PD大鼠腹膜組織E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)，F(xiàn)as 10 mg組比Fas 5 mg組上調(diào)更明顯(P<0.05)(圖5)。

討 論

PD是終末期腎病(ESRD)患者最主要的替代治療方法之一。然而長期PD可引起患者腹膜纖維化，導(dǎo)致超濾失敗，最終導(dǎo)致患者退出PD[1，2]。因此，深入探討腹膜纖維化的機(jī)制，對于預(yù)防和延緩纖維化的發(fā)生具有重要的意義。腹膜間皮細(xì)胞是腹膜組織的主要細(xì)胞，PD時腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT是引起腹膜纖維化的始動和可逆環(huán)節(jié)，是重要的致纖維化機(jī)制。本研究用4.25％葡萄糖透析液建立PD大鼠模型發(fā)現(xiàn),該大鼠模型磷酸化MYPT1水平明顯升高，證實Rho/Rho-kinase信號通路被顯著激活，并介導(dǎo)腹膜EMT及纖維化的發(fā)生。

Rho家族屬于小G蛋白超家族成員，它在多種細(xì)胞活動中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、遷移以及炎性細(xì)胞的黏附、吞噬等功能[6，7]。近年來，許多研究顯示Rho/Rho-kinase信號通路在多種組織細(xì)胞EMT及纖維化中也扮演重要角色[9-11]。Wu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Rho-kinase抑制劑法舒地爾能顯著下調(diào)糖尿病腎病大鼠腎α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)，上調(diào)E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)，從而改善腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，減輕腎纖維化的發(fā)生。Washida等[11]也發(fā)現(xiàn)，法舒地爾可下調(diào)腹膜α-SMA和纖維連接蛋白的蛋白表達(dá)，改善腹膜纖維化。本研究也發(fā)現(xiàn)PD大鼠腹膜α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，而法舒地爾能呈劑量依賴模式下調(diào)腹膜α-SMA蛋白及mRNA、上調(diào)腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)，明顯減輕腹膜EMT的發(fā)生。本研究同時發(fā)現(xiàn)法舒地爾呈劑量依賴模式增加PD大鼠超濾量、改善PD大鼠腹膜功能。這表明Rho/Rho-kinase信號通路在腹膜EMT及腹膜纖維化中起重要作用。

已有研究表明，TGF-β1信號通路在多種組織細(xì)胞EMT及纖維化中起重要作用，且通過抑制TGF-β1信號通路可顯著減輕EMT、纖維化的發(fā)生[3-5]。我們既往研究也發(fā)現(xiàn)TGF-β1信號通路在腹膜EMT及纖維化中也起關(guān)鍵作用[5]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Rho/Rho-kinase信號通路可能是通過調(diào)控TGF-β1通路而發(fā)揮其調(diào)控EMT及纖維化的作用。研究表明Rho-kinase抑制劑可下調(diào)TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞外基質(zhì)及α-SMA表達(dá)[11-16]。我們發(fā)現(xiàn)PD大鼠腹膜TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，而法舒地爾能呈劑量依賴模式下調(diào)腹膜TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)。

綜上所述，法舒地爾可顯著改善PD大鼠腹膜EMT的發(fā)生，并明顯改善腹膜功能，其機(jī)制可能與其調(diào)控TGF-β1信號通路密切相關(guān)。本研究表明，Rho/Rho-kinase信號通路在PD大鼠腹膜EMT及纖維化中起重要調(diào)控作用。因此，抑制Rho/Rho-kinase信號通路激活可有效阻止腹膜EMT，保護(hù)腹膜功能，為改善腹膜功能和結(jié)構(gòu)提供新的治療靶點。

1 Flessner MF.Peritoneal ultrafiltration:physiology and failure.Contrib Nephrol，2009;163:7-14.

2 van Westrhenen R，Zweers MM，Kunne C，et al.A pyruvate-buffered dialysis fluid induces less peritoneal angiogenesis and fibrosis than a conventional solution.Perit Dial Int，2008，28(5):487-496.

3 Margetts PJ，Oh KH，Kolb M.Transforming growth factor-beta:importance in long-term peritoneal membrane changes.Perit Dial Int，2005，25(Suppl 3):S15-S17.

4 Margetts PJ，Bonniaud P，Liu L，et al.Transient overexpression of TGF-{beta}1 induces epithelial mesenchymal transition in the rodent peritoneum.J Am Soc Nephrol，2005，16(2):425-436.

5 Nie J，Dou X，Hao W，et al.Smad7 gene transfer inhibits peritoneal fibrosis.Kidney Int，2007，72(11):1336-1344.

6 Riento K，Ridley AJ.Rocks:multifunctional kinases in cell behaviour.Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4(6):446-456.

7 Sun GP，Kohno M，Guo P，et al.Involvements of Rho-kinase and TGF-beta pathways in aldosterone-induced renal injury.J Am Soc Nephrol，2006，17(8):2193-2201.

8 Park JW，Park CH，Kim IJ，et al.Rho kinase inhibition by fasudil attenuates cyclosporine-induced kidney injury.J Pharmacol Exp Ther，2011，338(1):271-279.

9 Nagatoya K，Moriyama T，Kawada N，et al.Y-27632 prevents tubulointerstitial fibrosis in mouse kidneys with unilateral ureteral obstruction.Kidney Int，2002，61(5):1684-1695.

10 Wu G，Tu Y，Jia R.The influence of fasudil on the epithelial-mesenchymal transdifferentiation of renal tubular epithelial cells from diabetic rats.Biomed Pharmacother，2010，64(2):124-129.

11 Washida N，Wakino S，Tonozuka Y，et al.Rho-kinase inhibition ameliorates peritoneal fibrosis and angiogenesis in a rat model of peritoneal sclerosis.Nephrol Dial Transplant，2011，26(9):2770-2779.

12 Nishikimi T，Koshikawa S，Ishikawa Y，et al.Inhibition of Rho-kinase attenuates nephrosclerosis and improves survival in salt-loaded spontaneously hypertensive stroke-prone rats.J Hypertens，2007，25(5):1053-1063.

13 Compton LA，Potash DA，Mundell NA,et al.Transforming growth factor-beta induces loss of epithelial character and smooth muscle cell differentiation in epicardial cells.Dev Dyn，2006，235(1):82-93.

14 Masszi A，Di Ciano C，Sirokmány G，et al.Central role for Rho in TGF-beta1-induced alpha-smooth muscle actin expression during epithelial-mesenchymal transition.Am J Physiol Renal Physiol，2003，284(5):F911-F924.

15 Cho HJ，Yoo J.Rho activation is required for transforming growth factor-beta-induced epithelial-mesenchymal transition in lens epithelial cells.Cell Biol Int，2007，31(10):1225-1230.

16 Kolosionek E，Savai R，Ghofrani HA，et al.Expression and activity of phosphodiesterase isoforms during epithelial mesenchymal transition:the role of phosphodiesterase 4.Mol Biol Cell，2009，20(22):4751-4765.