采用熒光光譜法研究煙酸與牛血清白蛋白的相互作用

蔡向陽(yáng)，謝勇平，蔡碧瓊，鄭新宇，李清祿

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350002)

煙酸(nicotinic acid，NTA)是人體必需的13種維生素之一，已被廣泛用于治療由于低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)增多和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)減少所導(dǎo)致的血脂異常［1］，也是冠心病治療史上第一個(gè)顯示出可以減少該病死亡率的藥物［2］．血清白蛋白是人和動(dòng)物體內(nèi)血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，它不僅是維持血漿滲透壓的主要力量，在生理上還參與多種內(nèi)源、外源性物質(zhì)(如藥物和激素等)的存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)，使藥物等到達(dá)受體部位發(fā)揮作用．

目前，研究藥物等有機(jī)小分子與生物大分子的結(jié)合是藥物動(dòng)力學(xué)及臨床藥理學(xué)的重要內(nèi)容［3］．在NTA的藥理學(xué)研究中，人們普遍關(guān)注NTA受體及抗脂解作用的生物學(xué)機(jī)制，忽略了NTA與其受體結(jié)合的化學(xué)熱力學(xué)過(guò)程的研究．本試驗(yàn)采用熒光光譜法研究NTA與牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的相互作用，并計(jì)算兩者的結(jié)合常數(shù)(KA)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)等，其結(jié)果對(duì)了解NTA在體內(nèi)與受體結(jié)合、遷移和分布有重要的參考價(jià)值．

1 材料與方法

1．1 材料

儀器有Varian cary eclipse熒光分光光度計(jì)(美國(guó)瓦里安公司)、Cary-50紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó)瓦里安公司)、pB-10數(shù)字顯示酸度計(jì)(德國(guó)Sartorius集團(tuán))、SYC-15超級(jí)恒溫槽(南京桑力電子設(shè)備廠)．試劑有 NTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液(1．0 ×10－2mol·L－1)、BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液(2．00 ×10－5mol·L－1)、NaH2PO4-Na2HPO4(pH 7．40)緩沖液，其他試劑均為分析純，試驗(yàn)用水均為二次蒸餾水．

1．2 方法

1．2．1 NTA與BSA作用后的熒光光譜掃描 在8個(gè)10 mL的容量瓶中，各加入2 mL 20．0 μmol·L－1BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別加入不同濃度的NTA溶液，用NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液定容，搖勻，在測(cè)定溫度(T)下恒溫4 h．固定激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，激發(fā)狹縫5 nm，發(fā)射狹縫5 nm，掃描300－400 nm的熒光發(fā)射光譜．掃描完畢后，將波長(zhǎng)差分別固定在15和60 nm，掃描BSA的同步熒光光譜，重復(fù)測(cè)定3次．

1．2．2 NTA-BSA的紫外—可見光譜掃描 分別稀釋BSA和NTA至濃度為4．00 μmol·L－1，并對(duì)同濃度的NTA-BSA混合液分別進(jìn)行240－400 nm的紫外—可見光譜掃描．

2 結(jié)果與分析

2．1 NTA與BSA作用后的熒光光譜

固定BSA的濃度，加入NTA，以激發(fā)波長(zhǎng)(λex)為280 nm掃描體系的熒光光譜．圖1顯示:NTA對(duì)BSA的內(nèi)源性熒光起到猝滅作用;隨著NTA濃度的逐漸增大，BSA中的色氨酸在350 nm附近的熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度呈遞降趨勢(shì)［4］．可見，NTA與BSA之間發(fā)生了相互作用．

熒光猝滅可分為動(dòng)態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅等，且受溫度的影響較大．溫度升高，分子的熱運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增大，碰撞頻率提高，促進(jìn)內(nèi)源性熒光發(fā)生動(dòng)態(tài)猝滅;溫度降低，則有利于藥物分子與蛋白質(zhì)結(jié)合．不管是動(dòng)態(tài)猝滅還是靜態(tài)猝滅，其過(guò)程都可用 Stern-Volmer方程［4］進(jìn)行描述，即:

圖1 NTA與BSA相互作用的熒光光譜圖Fig．1 Fluorescencent spectra of NTA-BSA system

(1)式中，F(xiàn)0和F分別為猝滅劑Q加入前、后的熒光強(qiáng)度，Kq為雙分子猝滅過(guò)程的速率常數(shù)，Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，τ0為猝滅劑不存在時(shí)熒光體分子的平均壽命(約為10－8s)［6］，CQ為猝滅劑的濃度．根據(jù)(1)式求出猝滅過(guò)程的Kq和Ksv(表1)．

表1 NTA-BSA體系的Stern-Volmer方程1)Table 1 Stern-Volmer equations of NTA-BSA system

為闡明其猝滅機(jī)制，繪制出不同溫度下BSA與NTA相互作用的Stern-Volmer線．從圖2可以看出，F(xiàn)0/F與NTA濃度呈良好的線性關(guān)系，且隨著NTA濃度的增加而增大;溫度升高，斜率變大，即Ksv變大．Wang et al［7］認(rèn)為:對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅，Ksv隨著溫度的升高而增大;對(duì)于靜態(tài)猝滅，則溫度的升高使猝滅常數(shù)減?。梢姡琋TA與BSA的猝滅效應(yīng)屬于動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)理．

2．2 NTA與BSA相互作用的KA和n

藥物小分子與蛋白質(zhì)大分子的相互作用通常用KA和n來(lái)描述［8］．NTA與BSA相互作用的KA和n采用Lineweaver-Burk方程計(jì)算:

根據(jù)(2)式作lg［(F0－F)/F］與lgCQ雙對(duì)數(shù)曲線，擬合后的結(jié)果見圖3．由圖3可見，lg［(F0－F)/F］與lgCQ呈良好的線性關(guān)系，溫度升高，斜率變大，且變化趨勢(shì)同圖2的結(jié)果一致．

根據(jù)圖3擬合得到的Lineweaver－Burk方程求出NTA與BSA作用的KA和n(表2)．

圖2 NTA對(duì)BSA熒光猝滅作用的Stern-Volmer線Fig．2 Stern-Volmer lines of BSA quenched by NTA

圖3 NTA對(duì)BSA熒光猝滅作用的Lineweaver-Burk線Fig．3 Lineweaver-Burk lines of BSA quenched by NTA

表2 NTA與BSA的KA和nTable 2 Binding constants and binding sites of BSA-NTA

由表2可知:NTA與BSA之間的KA較小，表明作用較弱，分子間大致可形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn);兩者的結(jié)合受到溫度的影響較為顯著．在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，其KA隨著溫度的升高有所增大．

2．3 NTA與BSA相互作用力的熱力學(xué)參數(shù)

在溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的焓變(ΔH)可以看作一個(gè)常數(shù)，根據(jù)Van't Hoff等壓方程(3)可以求出NTA與BSA結(jié)合反應(yīng)的ΔH．

根據(jù)(4)式可求出NTA與BSA結(jié)合反應(yīng)的吉布斯自由能變(ΔG)和熵變(ΔS)．

求得的NTA與BSA結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)見表3．

根據(jù)ΔH和ΔS的相對(duì)大小，可以判斷藥物與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型［10］．由表3可知:NTA與 BSA結(jié)合反應(yīng)的 ΔH＞0，ΔS＞0，表明NTA與BSA之間主要以疏水作用力相結(jié)合［11］;ΔG＜0表明NTA與BSA在常溫下具有自發(fā)結(jié)合的趨勢(shì)，溫度升高，ΔG變得更負(fù)，表明溫度升高結(jié)合的趨勢(shì)增強(qiáng)，這與KA隨著溫度的升高而增大的結(jié)果一致．

表3 NTA與BSA結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of interaction between NTA and BSA

2．4 NTA對(duì)BSA構(gòu)象的影響

固定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)差(Δλ)分別為15和60 nm，即分別對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的光譜特征［9］，掃描同步熒光光譜，以分析蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化．由圖4可知，隨著NTA濃度的增加，雖然BSA的同步熒光強(qiáng)度逐漸減弱，但最大發(fā)射峰的峰形和峰位均基本不變．表明NTA的加入并沒(méi)有影響B(tài)SA的構(gòu)象．

圖4 NTA的與BSA相互作用的恒波長(zhǎng)同步熒光光譜Fig．4 Constant wavelength synchronous fluorescence spectra of NTA-BSA

2．5 NTA與BSA作用的紫外吸收光譜

分別測(cè)定濃度為4．00×10－6mol·L－1的BSA、NTA和NTA-BSA混合液的紫外吸收光譜，結(jié)果如圖5、6所示．將NTA、BSA紫外吸收光譜的疊加線與NTA-BSA混合液的紫外吸收光譜對(duì)比，紫外吸收峰的峰形與峰位基本不變，這表明NTA的加入并未使BSA的紫外吸收發(fā)生變化．藥物對(duì)BSA的熒光猝滅是由于它與BSA的激發(fā)態(tài)分子發(fā)生了相互作用，即猝滅機(jī)理為動(dòng)態(tài)猝滅．

圖5 NTA、BSA的紫外吸收光譜Fig．5 Ultraviolet-vis spectrometry of NTA and BSA

圖6 NTA-BSA混合液的紫外吸收光譜Fig．6 Ultraviolet-vis spectrometry of NTA-BSA

3 結(jié)論

采用熒光光譜分析法，輔以紫外光譜分析，研究了NTA與BSA之間的相互作用．結(jié)果表明，NTA能猝滅BSA的內(nèi)源性熒光，且以動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)制為主．熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算表明，在T為293和310 K時(shí)，NTA與BSA的KA分別為31．9和72．9 L·mol－1，二者以疏水力作用為主，二者間只有弱的結(jié)合．同步熒光光譜和紫外光譜分析表明了NTA的加入沒(méi)有引起B(yǎng)SA構(gòu)象的變化．本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)于闡明NTA的藥物作用機(jī)制以及藥代動(dòng)力學(xué)等方面具有重要的參考價(jià)值．

［1］關(guān)靜，霍艷艷，董春嬌．煙酸類藥物的研究進(jìn)展［J］．沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，13(2):110－112．

［2］CARLSON L A．Nicotinic acid:the broad-spectrum lipid drug．A 50th anniversary review［J］．J Intern Med，2005，258:94－114．

［3］薛紅波，李春涯，高蘭昌，等．維生素B1與牛血清白蛋白的相互作用［J］．分析試驗(yàn)室，2011，30(4):111－114．

［4］林玉龍，王靜，楊彩琴，等．齊墩果酸與牛血清白蛋白相互作用的光譜研究［J］．分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2011，27(4):483－486．

［5］YANG M M，XI X L，YANG P．Comparison of reasonableness of the fluorescence quenching and enhancement equations at different temperatures［J］．Acta Chim Sin，2006，64(14):1437 －1445．

［6］LAKOWICZ J R，WEBER G．Quenching of protein fluorescence by oxygen detection of structural fluctuations in proteins on the nanosecond time scale［J］．Biochemistry，1973，12(21):4171 －4179．

［7］WANG Y Q，ZHANG H M，ZHANG G C．Studies of the interaction between palmatine hydrochloride and human serum albumin by fluorescence quenching method［J］．Pharm Biomed Anal，2006，41(3):1041 －1046．

［8］XIE M X，XU X Y，WANGY D，et al．Interaction between hesperetin and human serum album in revealed by spectroscopic methods［J］．Biochim Biophys Acta，2005，1724:215 －224．

［9］何華，葉海英，黛麗，等．洛美沙星-Tb3+配合物與BSA相互作用的熒光光譜研究［J］．光譜學(xué)與光譜分析，2006，26(3):480－483．

［10］TIMASHEFF S N．Thermodynamics of protein interactions［M］∥PEETERS H．Proteins of Biological Fluids．Oxford:Pergam on Press，1972:511．

［11］ROSS D P，SUBRAMANIAN S．Thermodynamics of protein association reactions:Forces contributing to stability［J］．Biochemistry，1981，20(11):3096 －3102．