陳醋生高粱糖化菌株的篩選

許云蕭，郝 林*

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷 030801）

傳統(tǒng)陳醋的生產(chǎn)中，高溫蒸煮工藝耗能約占整個(gè)生產(chǎn)總耗能的30%～40%左右[1]，大量燃煤不僅會(huì)造成能源的浪費(fèi)，而且會(huì)引發(fā)環(huán)境污染。構(gòu)成霧霾的三大成分——二氧化硫、氮氧化物和可吸入顆粒物均是燃煤鍋爐排放的廢氣的成分，燃煤排放的煙塵中有許多無法去除的超細(xì)顆粒，是PM2.5一次細(xì)顆粒的主要來源。減少蒸煮工藝，在保證質(zhì)量的同時(shí)實(shí)現(xiàn)節(jié)能減排是陳醋生產(chǎn)企業(yè)未來發(fā)展的一個(gè)方向，生料糖化技術(shù)因此應(yīng)運(yùn)而生。生淀粉的糖化不經(jīng)過蒸煮糊化，而是通過生淀粉對(duì)糖化酶的吸附，糖化酶從淀粉的非還原性末端水解α-1，4葡萄糖苷鍵和α-1，6葡萄糖苷鍵得到還原糖，降解淀粉。本試驗(yàn)首先通過查閱相關(guān)資料選擇產(chǎn)糖化酶較多的3種黑曲霉菌株，然后對(duì)3株菌株產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，使菌株的產(chǎn)糖化酶的能力得到提高，最后從中篩選出最優(yōu)的適宜生高粱糖化的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

黑曲霉H303-4-3：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院生物工程系保藏；黑曲霉AS.3324：中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；黑曲霉cicc2137：中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院。

1.1.2 主要儀器和設(shè)備

電子萬用爐：天津市泰斯特儀器有限公司；雷磁pH-S數(shù)顯pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；儀表恒溫水浴鍋：上海樹立儀器儀表有限公司。

1.1.3 主要試劑和藥品

a）0.1mol/L乙酸—乙酸鈉緩沖液（pH=4.6）：秤取6.7g乙酸鈉，吸取冰醋酸2.6mL，用蒸餾水溶解定容至1000mL，然后以酸度計(jì)校正pH值。

b）0.05mol/L Na2SO3溶液：秤取硫代硫酸鈉8g，加0.2g碳酸鈉，煮沸10min，定容至1000mL，3d后用。

c）0.1mol/L I2液：5g碘化鉀，水溶后加入2.54g碘，定容至100mL。

d）0.1mol/L NaOH溶液：5mL NaOH飽和溶液定容至1000mL。

e）2mol/L H2SO4：量取分析純濃硫酸5.6mL，緩慢加入適量蒸餾水中，冷卻后用蒸餾水定容至100mL。

f）20%NaOH。

g）2%可溶性淀粉溶液。

h）斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

i）初始麩曲培養(yǎng)基：15g麩皮，12mL水，自然pH值，混勻后潤(rùn)料1h。121℃高壓滅菌30min，趁熱打散。

j）麩皮、豆粕均為市售。

1.2 方法

1.2.1 麩曲的制作

在打散的麩皮培養(yǎng)基上接種三環(huán)試驗(yàn)菌種，8層紗布封口，30℃培養(yǎng)1d時(shí)搖瓶，2d時(shí)扣瓶培養(yǎng)。制成的麩曲要求內(nèi)外底層菌生長(zhǎng)均勻，無雜菌污染，無異味，有特殊的曲香，糖化發(fā)酵力強(qiáng)。

1.2.2 粗酶液的提取

秤取制作的干曲（換算成絕干曲5g），用約50mL乙酸—乙酸鈉緩沖液（pH=4.6）在常溫條件下攪拌浸泡1h后，用脫脂棉濾出浸出液，定容至50mL即為粗酶液。

1.2.3 糖化酶活力的測(cè)定及計(jì)算[2]

于甲、乙兩只比色管中，分別加入2%可溶性淀粉溶液25mL，0.1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液5mL。搖勻后在40℃水浴鍋中預(yù)熱5min，在甲管中加入酶液2mL，搖勻后計(jì)時(shí)反應(yīng)1h后立即在2管中加入20%NaOH 0.2mL終止反應(yīng)，冷水冷卻后在乙管中加2mL酶液。取2管中上述反應(yīng)液各5mL放入碘量瓶。加入0.1mol/L I2液10mL，0.1mol/L NaOH 15mL，放暗處15min，取出加H2SO42mL搖勻，用Na2SO3滴定至無色。

式中：X 為糖化酶活力（U/mL）；A 為空白消耗Na2SO3數(shù)（乙管）；B 為樣品消耗Na2SO3數(shù)（甲管）；c 為Na2SO3物質(zhì)的量濃度；90.05 為1mL 1mol/L Na2SO3相當(dāng)葡萄糖的數(shù)；1/2 為折成1mL 酶液的量；32.2 為反應(yīng)液總體積；5 為吸取反應(yīng)液毫升數(shù)；n 為稀釋倍數(shù)。

生淀粉糖化酶活力的測(cè)定：在40℃、pH=4.6條件下，1g干麩曲1h降解生淀粉釋放1mg葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活力單位[2]。測(cè)定方法同糖化酶活力的測(cè)定，將可溶性淀粉改為生淀粉。

1.2.4 生淀粉對(duì)酶液吸附率的測(cè)定[2]

1g生淀粉用5倍的粗酶液在40℃、pH=3.6的檸檬酸緩沖液中振蕩攪拌15min，離心分離，取上清液測(cè)定淀粉酶活力A，測(cè)粗酶液酶活力B，計(jì)算吸附率AB：

1.2.5 麩曲的感官及理化分析[3]

a.水分測(cè)定

準(zhǔn)確稱取待測(cè)的麩曲5g，放入事先烘干，恒重的培養(yǎng)皿中，在115℃烘箱中烘至恒重，加蓋在干燥器中冷卻30min，稱重。

式中：m0為空培養(yǎng)皿質(zhì)量（g）；m 為空培養(yǎng)皿加試樣質(zhì)量（g）；m1為空培養(yǎng)皿加烘干后試樣質(zhì)量（g）。

b.糖化酶活力測(cè)定

同1.2.3 糖化酶活力定義：1.0g酶粉于40℃、pH4.6條件下，1h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖，即為1個(gè)酶活力單位，以U/g表示。

c.酶活力保存率測(cè)定

根據(jù)測(cè)出的麩曲的最高酶活力與每天測(cè)酶活的比值，可以算出試樣麩曲酶活力的保存力。

式中：X 為樣品酶活力保存率（%）；E1為樣品實(shí)測(cè)酶活力（U/g）；E 為樣品最高酶活力（U/g）。

d.麩曲的感官評(píng)定

從麩曲內(nèi)外層菌絲分布是否均勻，顏色是否一致，是否含有雜物，有無結(jié)塊現(xiàn)象，氣味幾個(gè)方面來判斷。

2 結(jié)果與分析

2.1 AS.3324菌株產(chǎn)糖化酶條件的優(yōu)化

在預(yù)試驗(yàn)中，對(duì)AS.3324菌株的初始產(chǎn)糖化酶條件進(jìn)行了確定，經(jīng)過試驗(yàn)得出在麩曲培養(yǎng)基裝瓶量為20g，接種3環(huán)孢子，30℃的條件下培養(yǎng)4d，AS.3324的產(chǎn)糖化酶能力最強(qiáng)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行以下條件的優(yōu)化[4-8]。

2.1.1 菌齡對(duì)酶活的影響

在上述條件下，接種不同生長(zhǎng)時(shí)間的菌株于培養(yǎng)基，測(cè)其糖化力，結(jié)果見表1。在菌株培養(yǎng)到第3d時(shí)接種，AS.3324的糖化力最強(qiáng)。此時(shí)孢子剛由黃色變?yōu)楹谏?，糖化酶的活力?qiáng)。

表1 菌齡對(duì)酶活的影響Table 1 Effect of fungus age on enzyme activity

2.1.2 麩皮與水分比例對(duì)酶活的影響

在2.1.1的條件下，改變麩皮與水分的配比，測(cè)糖化酶的活力，結(jié)果見表2。在麩皮與水分的比例為15∶12時(shí)，AS.3324產(chǎn)糖化酶的活力最強(qiáng)。通過觀察麩曲的表面、橫斷面和底面，在水分含量較少的情況下，孢子分布不均勻，表層和底層孢子較多，呈該菌成熟的黑色，內(nèi)層孢子生長(zhǎng)較少，麩曲質(zhì)量較差。在水分含量多的情況下，麩皮培養(yǎng)基不易打散，黏度較大，含氧量下降，不利于菌株的生長(zhǎng)，在后期的存放過程中，容易被其他菌污染。

表2 麩皮與水分比例對(duì)酶活的影響Table 2 Effect of bran and moisture ratio on enzyme activity

2.1.3 pH值對(duì)酶活的影響

在2.1.2的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，于不同的初始pH值條件下培養(yǎng)AS.3324，測(cè)定糖化酶活力，結(jié)果見表3。由表3看出，在pH值為5時(shí)，AS.3324的糖化酶活力最強(qiáng)。

表3 pH 值對(duì)酶活的影響Table 3 Effect of pH value on enzyme activity

2.1.4 麩皮∶豆粕對(duì)酶活的影響

在2.1.3 的試驗(yàn)結(jié)果下，將AS.3324接種在不同碳源和氮源的培養(yǎng)基上，結(jié)果見表4。在麩皮和豆粕的比例為3∶2時(shí)，菌株的糖化酶活力最高。麩皮來源廣泛，價(jià)格低廉，而且含有豐富的氮及其他微生物生長(zhǎng)的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于糖化酶的產(chǎn)生。所以在單獨(dú)使用麩皮作為培養(yǎng)基時(shí)，菌株的糖化力也很高。在陳醋的生產(chǎn)過程中，麩皮還作為醋的輔料。

表4 麩皮∶豆粕對(duì)酶活的影響Table 4 Effect of nitrogen and carbon sources ratio on enzyme activity

綜上，在麩皮與豆粕的比例為3∶2，麩皮與水分的比例為15∶12，pH值為5，裝瓶量為20g的條件下，接種培養(yǎng)3d的菌株，30℃培養(yǎng)4d，AS.3324 的糖化酶活力最 高，達(dá)2044.23U/g。

根據(jù)上述方法，分別再對(duì)cicc2137、H303-4-3的產(chǎn)糖化酶條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 cicc2137菌株產(chǎn)糖化酶條件的優(yōu)化

在預(yù)試驗(yàn)中確定了菌株cicc2137的初始產(chǎn)糖化酶條件，即在麩曲培養(yǎng)基裝瓶量為20g，接種3環(huán)孢子，30℃的條件下培養(yǎng)3d，cicc2137的糖化酶活力最強(qiáng)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行以下條件的優(yōu)化。

2.2.1 菌齡對(duì)酶活的影響

在上述試驗(yàn)結(jié)果下，接種不同培養(yǎng)時(shí)間的cicc2137，結(jié)果如下：在麩皮培養(yǎng)基上，接種培養(yǎng)3d的菌株得到的麩曲培養(yǎng)基的糖化力最強(qiáng)。

表5 菌齡對(duì)酶活的影響Table 5 Effect of fungus age on enzyme activity

2.2.2 麩皮與水分比例對(duì)酶活的影響

根據(jù)2.2.1的試驗(yàn)結(jié)果，在不同的麩皮與水分比例下接種菌株，結(jié)果見表6。在麩皮∶水=15∶13時(shí)，cicc2137的酶活力高達(dá)2450.17U/g。

2.2.3 pH值對(duì)酶活的影響

表6 麩皮與水分比例對(duì)酶活的影響Table 6 Effect of bran and moisture ratio on enzyme activity

表7 pH 值對(duì)酶活的影響Table 7 Effect of pH value on enzyme activity

在2.2.2的條件下，選取不同的pH值進(jìn)行菌株的培養(yǎng)。結(jié)果見表7。在pH值為4時(shí)，菌株糖化酶酶活力最高。但cicc2137對(duì)pH值的變化較敏感，不利于醋生產(chǎn)中的應(yīng)用。

2.2.4 碳氮比對(duì)酶活的影響

在2.2.3的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，在不同的麩皮與豆粕比條件下培養(yǎng)cicc2137，結(jié)果見表8。在C∶N為4∶1時(shí)，菌株的糖化力最強(qiáng)。

表8 C∶N 對(duì)酶活的影響Table 8 Effect of nitrogen and carbon sources ratio on enzyme activity

綜上，在麩皮與豆粕的比例為4∶1，麩皮與水分的比例為15∶13，pH值為4，裝瓶量為20g的條件下，接種培養(yǎng)3d的菌株，30℃培養(yǎng)3d，cicc2137 的糖化酶活力最高，達(dá)2624.14U/g。

2.3 H303-4-3菌株產(chǎn)糖化酶條件的優(yōu)化

在預(yù)試驗(yàn)中，對(duì)H303-4-3菌株的初始產(chǎn)糖化酶條件進(jìn)行了確定，經(jīng)過試驗(yàn)確定在麩曲培養(yǎng)基裝瓶量為15g，接種3環(huán)孢子，30℃的條件下培養(yǎng)4d，H303-4-3的產(chǎn)糖化酶能力最強(qiáng)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行以下條件的優(yōu)化：

2.3.1 菌齡對(duì)酶活的影響

在上述的試驗(yàn)結(jié)果下，將培養(yǎng)不同時(shí)間的H303-4-3接種在麩皮培養(yǎng)基上，結(jié)果見表9。H303-4-3生長(zhǎng)到第4d接種時(shí)，糖化酶活力最高。

表9 菌齡對(duì)酶活的影響Table 9 Effect of fungus age on enzyme activity

2.3.2 麩皮與水分比例對(duì)酶活的影響

根據(jù)2.3.1的試驗(yàn)結(jié)果，將菌株接種在不同麩皮與水分比例的培養(yǎng)基上測(cè)其糖化力。結(jié)果表明，在麩皮∶水分的比例為15∶10的時(shí)候，H303-4-3的糖化力最強(qiáng)。

2.3.3 pH值對(duì)酶活的影響

在2.3.2的結(jié)果下，將菌株接種在不同pH值的培養(yǎng)基上，試驗(yàn)結(jié)果見表10。在pH值為5時(shí)，菌株的酶活力達(dá)2551.66U/g。

表10 麩皮與水分比例對(duì)酶活的影響Table 10 Effect of bran and moisture ratio on enzyme activity

表11 pH 值對(duì)酶活的影響Table 11 Effect of pH value on enzyme activity

2.3.4 碳氮比對(duì)酶活的影響

依據(jù)2.3.3的試驗(yàn)結(jié)果，將H303-4-3接種在不同比例碳源和氮源的培養(yǎng)基上，結(jié)果見表12。在麩皮和豆粕的比例為4∶1時(shí)，菌株的糖化酶活力最高。

表12 C∶N 對(duì)酶活的影響Table 12 Effect of nitrogen and carbon sources ratio on enzyme activity

綜上，在麩皮與豆粕的比例為4∶1，麩皮與水分的比例為15∶10，pH值為5，裝瓶量為15g的條件下，接種培養(yǎng)4d的菌株，30℃培養(yǎng)4d，H303-4-3的糖化酶活力最高，達(dá)2783.63U/g。

2.4 所選菌株與生產(chǎn)用大曲的各項(xiàng)指標(biāo)比較

對(duì)市售生產(chǎn)陳醋用的紅心大曲、后火大曲和清渣大曲[3]的糖化力進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)3種大曲及所選3種菌株的生淀粉糖化力、吸附率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見附圖。所選菌株黑曲霉H303-4-3、AS.3324、cicc2137的酶活、生淀粉糖化力、吸附率均高于市售陳醋大曲，AS.3324的糖化酶活力低于cicc2137，對(duì)生淀粉的糖化力較強(qiáng)，但其酶活力隨菌株生長(zhǎng)的時(shí)間下降過快，不利于生產(chǎn)中的應(yīng)用；cicc2137雖酶活較高，但其生淀粉糖化力、吸附率都比較低，這不利于生料釀醋工藝；H303-4-3的各項(xiàng)指標(biāo)最優(yōu)，最適宜，耐酸性較好，且對(duì)生淀粉的糖化力、吸附率都明顯高于生產(chǎn)用大曲，對(duì)H303-4-3進(jìn)行感官和理化指標(biāo)的測(cè)定，其糖化酶活力為2798.12U/g，3個(gè)月后酶活力保存率≥86%，水分含量≤10%，內(nèi)外菌體生長(zhǎng)一致，顏色為淺褐色，無結(jié)塊，無酸、霉等異味，無雜質(zhì)，為麩曲特殊的清香。所以H303-4-3可以作為陳醋生高粱糖化的優(yōu)選菌株。

附圖 3種大曲及所選3個(gè)菌株的酶活、生淀粉糖化力、生淀粉對(duì)酶的吸附率Attached Fig.Three kinds of daqu and the selected three strains of enzyme activity,starch saccharifying power and crude starch on enzyme adsorption rate

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對(duì)所選3個(gè)菌株產(chǎn)糖化酶的條件進(jìn)行優(yōu)化，得到了每個(gè)菌株的最優(yōu)產(chǎn)酶條件。經(jīng)過優(yōu)化后H303-4-3菌株的糖化酶活力最高：在麩皮與豆粕的比例為4∶1，麩皮與水分的比例為15∶10，pH值為5，裝瓶量為15g的條件下，接種培養(yǎng)4d的菌株，30℃培養(yǎng)4d，H303-4-3的糖化酶活力達(dá)2783.63U/g。通過各項(xiàng)指標(biāo)與陳醋大曲進(jìn)行比較，最終確定黑曲霉H303-4-3作為陳醋生高粱糖化的菌株。若將所篩選出的菌株制成大曲強(qiáng)化劑，加入到傳統(tǒng)制醋生產(chǎn)大曲中，可以在保留傳統(tǒng)陳醋生產(chǎn)工藝的同時(shí)，使陳醋生產(chǎn)向生料糖化轉(zhuǎn)變，在保證陳醋品質(zhì)的前提下實(shí)現(xiàn)企業(yè)的節(jié)能減排。

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