C反應(yīng)蛋白和生長(zhǎng)停滯特異性基因產(chǎn)物6基因交互作用與中國(guó)漢族人群缺血性腦卒中及其亞型的關(guān)聯(lián)研究

李曉峰，陳忠云，李 婧，高永俊，趙曉麗，趙 靜，楊 旭

卒中是人類致死和致殘的世界第二大疾病[1]，其中，75%是缺血性腦卒中(IS)。但傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素，如高血壓、糖尿病、肥胖、吸煙等不能解釋所有的卒中事件。研究表明，遺傳因素在IS易患性中起著重要作用[2-3]；炎癥反應(yīng)與IS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、進(jìn)展及結(jié)局亦密切相關(guān)[4]。因此，編碼炎性分子的基因變異可能影響IS的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，且已有許多關(guān)于不同的炎性候選基因與IS的發(fā)病機(jī)制的研究[5-6]。如C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、生長(zhǎng)停滯特異性基因產(chǎn)物6(growth arrest-specific gene 6,GAS6)等[7-9]。但隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)單個(gè)位點(diǎn)的主效應(yīng)可能僅引起較弱的效應(yīng)，因此，越來(lái)越多的學(xué)者們致力于研究不同基因之間的交互作用。在此背景下，本研究采用回顧性病例對(duì)照研究，評(píng)價(jià)促血栓和促動(dòng)脈粥樣硬化的CRP和GAS6基因多態(tài)性的獨(dú)立效應(yīng)，并進(jìn)一步采用基于多因素降維法(multifactor dimensionality reduction,MDR)的廣義的多因素降維法(generalized multifactor dimensionality reduction,GMDR)對(duì)二者之間潛在的基因-基因交互作用進(jìn)行研究。鑒于不同的卒中亞型有不同的遺傳因素，本研究亦對(duì)IS亞型進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用回顧性病例對(duì)照研究。于2010年10月—2012年12月連續(xù)收集入住航天中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的IS患者129例為病例組，其中男86例，女43例；平均年齡(67.0±9.8)歲；均為發(fā)病5 d內(nèi)入選。所有患者于入院48 h內(nèi)經(jīng)顱腦CT或MRI證實(shí)，并以頸部血管超聲、顱腦彩色多普勒(必要時(shí)行顱腦CT血管造影或磁共振血管造影等檢查)評(píng)價(jià)腦血管狀態(tài)，IS診斷符合WHO卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。同時(shí)根據(jù)TOAST分型[11]，分為大動(dòng)脈粥樣硬化性腦卒中(large-artery atherosclerosis，LAA )91例和小動(dòng)脈閉塞性腦卒中或腔隙性腦卒中(small-artery occlusion，SAA)38例，同時(shí)剔除心源性栓塞、其他原因類型(SOD)及不明原因(SUD)的IS患者。同期從體檢中心隨機(jī)選取非IS者192例為對(duì)照組，其中男90例，女102例；平均年齡(67.2±6.2)歲；根據(jù)臨床分析和實(shí)驗(yàn)室評(píng)估，除患有高血壓、糖尿病和冠心病外，無(wú)其他任何身體不適。

1.2 資料收集 測(cè)量血壓、血糖、血脂、身高、體質(zhì)量，計(jì)算體質(zhì)指數(shù)(BMI)；詢問(wèn)冠心病病史、腦卒中家族史、吸煙史、飲酒史等。高血壓定義為收縮壓≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和(或)舒張壓≥90 mm Hg或當(dāng)前應(yīng)用降壓藥物；糖尿病定義為目前服用降糖藥物，或空腹血糖≥7.0 mmol/L。冠心病定義為既往有明確的心絞痛、心肌梗死病史。腦卒中家族史定義為至少有1個(gè)一級(jí)直系親屬曾患腦梗死。吸煙史定義為5年吸煙>10支/d。飲酒史定義為至少每星期飲酒1次，且每次>50 ml，連續(xù)半年以上。以BMI≥25 kg/m2為肥胖和(或)超重。如果與患者無(wú)法溝通，可通過(guò)其直系親屬采集病史資料。本研究協(xié)議經(jīng)當(dāng)?shù)貍惱韰f(xié)會(huì)和醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.3 單核苷酸多態(tài)性(SNP)選擇及基因型確定 既往研究發(fā)現(xiàn)的GAS6 SNP位點(diǎn)中，僅有第8內(nèi)含子rs8191974:G>A基因型頻率有差異，因此本研究選擇此位點(diǎn)。同時(shí)依據(jù)HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.hapmap.org)，并運(yùn)用Haploview 3.0軟件(http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/)，在HapMap Format中讀取CHB數(shù)據(jù)，設(shè)置最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)的最小值為0.01，以SNP之間r2>0.8的原則，選擇CRP rs1130864:C>T和rs3093059:T>C、GAS6 rs8191974:G>A和rs7400722:C>T共4個(gè)SNP位點(diǎn)。

研究對(duì)象于次日清晨采集空腹靜脈血2 ml(EDTA抗凝)，用鹽析法提取外周白細(xì)胞中基因組DNA。采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)檢測(cè)各SNP基因型，所用引物均應(yīng)用軟件Premier 5.0自行設(shè)計(jì)，上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。PCR產(chǎn)物由2 U限制性內(nèi)切酶(NEB公司) 進(jìn)行消化，65 ℃溫育1 h，反應(yīng)終產(chǎn)物經(jīng)含溴化乙錠的3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物。分型后取5%樣本量行直接測(cè)序驗(yàn)證(見(jiàn)表 1)。

表1 CRP和GAS6 SNP引物序列、限制性內(nèi)切酶和酶切產(chǎn)物長(zhǎng)度

注：F為正向引物，R為反向引物

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組與病例組一般資料比較 對(duì)照組與病例組年齡、BMI比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組比較，病例組男性比例、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)水平及高血壓病史、糖尿病病史、冠心病病史、腦卒中家族史、吸煙史、飲酒史比例升高，總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組與LAA組、SAA組年齡、BMI比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組比較，LAA組和SAA組男性比例、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、TG、LDL水平及高血壓病史、糖尿病病史、冠心病病史、吸煙史比例升高，TC、HDL水平降低，LAA組腦卒中家族史、飲酒史比例升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

表2 對(duì)照組與病例組一般資料比較

注：LAA=大動(dòng)脈粥樣硬化性腦卒中，SAA=小動(dòng)脈閉塞性腦卒中或腔隙性腦卒中，BMI=體質(zhì)指數(shù)，TC=總膽固醇、TG=三酰甘油，HDL=高密度脂蛋白，LDL=低密度脂蛋白；與對(duì)照組比較，*P<0.05；△為χ2值；☆為對(duì)照組與病例組比較；★為對(duì)照組、LAA組、SAA組比較

2.2 基因型分析 CRP rs3093059:T>C和 rs1130864:C>T、GAS6 rs8191974:G>A和rs7400722:C>T 4個(gè)SNP位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，基因頻率能夠代表群體的基因分布。對(duì)照組與病例組，對(duì)照組與LAA、SAA組基因型分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表 3)。

表3 不同組間基因型分布比較(例)

注：☆為對(duì)照組與病例組比較；★為對(duì)照組、LAA組、SAA組比較

2.3 基因-基因交互作用與IS易患性分析 LAA組基因交互作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CRP rs3093059和GAS6 rs7400722為最佳交互作用模型(檢驗(yàn)樣本一致性=61.29%；交叉驗(yàn)證一致性=10；P=0.0107，見(jiàn)表4～6)。

表4 對(duì)照組與病例組GMDR分析結(jié)果

注：X1= rs1130864，X2= rs3093059，X3= rs8191974，X4=rs7400722

進(jìn)一步采用樹(shù)狀圖分析二者之間的交互作用。CRP rs3093059與GAS6 rs7400722在相同分支，且相互靠近。而CRP rs1130864與GAS6 rs8191974在不同分支，且距離較遠(yuǎn)(見(jiàn)圖1)。

交互放射圖顯示CRP rs3093059與GAS6 rs7400722具有明顯的交互效應(yīng)。獨(dú)立分析顯示CRP rs3093059 占1.08%，GAS6 rs7400722占1.04%，兩個(gè)SNP間的交互作用在交互放射圖中占主導(dǎo)地位(1.49%，見(jiàn)圖2)。

表5 對(duì)照組與LAA組GMDR分析結(jié)果

注：X1= rs1130864，X2= rs3093059，X3= rs8191974，X4=rs7400722

表6 對(duì)照組與SAA組GMDR分析結(jié)果

注：X1= rs1130864，X2= rs3093059，X3= rs8191974，X4=rs7400722

圖1 LAA組的交互樹(shù)狀圖

圖2 LAA組的交互放射圖

2.4 Logistic回歸分析 rs3093059 TC+CC和rs7400722 CT+TT具有較高的LAA發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(P=0.041)，進(jìn)一步采用多因素Logistic回歸分析，校正高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒、冠心病和腦卒中家族史相關(guān)危險(xiǎn)因素后，結(jié)果亦未改變(P=0.039，見(jiàn)表7)。

表7 rs3093059與rs7400722聯(lián)合作用與LAA的相關(guān)性

3 討論

本研究依據(jù)既往研究結(jié)果及HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇中國(guó)漢族人群CRP基因rs3093059:T>C和rs1130864:C>T、GAS6基因rs8191974:G>A和rs7400722:C>T 4個(gè)SNP位點(diǎn)探討炎性基因間交互作用與IS及其亞型相關(guān)性。單位點(diǎn)分析表明，4個(gè)SNP位點(diǎn)與IS及其亞型的發(fā)生均無(wú)相關(guān)性，與既往Kuhlenbaeumer等[8]、Hurtado等[9]的研究結(jié)果一致。

MDR是由Ritchie等[12]首次在研究散發(fā)性乳腺癌的研究中使用。MDR雖不能分析危險(xiǎn)因素的主效應(yīng)，但能發(fā)現(xiàn)高階的交互作用，尤其適合在發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的疾病中探討基因-基因、基因-環(huán)境之間的交互作用，可以更好地解釋疾病基因水平的發(fā)病機(jī)制。本研究采用GMDR分析發(fā)現(xiàn)，LAA組rs3093059:T>C與rs7400722:C>T之間存在交互作用。多因素Logistic回歸分析表明，隱性模型rs3093059 TC+CC和rs7400722 CT+TT與rs3093059 TT和rs7400722 CC相比，具有較高的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，校正相關(guān)危險(xiǎn)因素后，結(jié)果一樣。表明CRP rs3093059 C與GAS6 rs7400722 T二者可能共同促進(jìn)了LAA的發(fā)生。

CRP是一種急性炎癥時(shí)相反應(yīng)蛋白，既往研究表明，其可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的產(chǎn)生[10，13]，促使原型LDL形成泡沫細(xì)胞[11，14]，通過(guò)受體介導(dǎo)的趨化反應(yīng)募集單核細(xì)胞[15]，并誘導(dǎo)其釋放組織因子[16]，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，進(jìn)而導(dǎo)致IS的發(fā)生。rs3093059:T>C位于CRP基因假定的啟動(dòng)子區(qū)，其可能在一定程度上調(diào)控CRP的表達(dá)，影響血清CRP水平。目前關(guān)于該位點(diǎn)的相關(guān)性研究尚少，國(guó)內(nèi)學(xué)者Shen等[17]采用病例對(duì)照研究，檢測(cè)了中國(guó)漢族548例IS患者和993例非IS對(duì)照人群rs3093059的SNP，結(jié)果顯示rs3093059加性模型〔OR=0.697，95%CI(0.528，0.921)，P=0.011〕、顯性模型〔OR=0.671，95%CI(0.487,0.923)，P=0.044〕及最小等位基因C〔OR=0.811，95%CI(0.666，0.988)，P=0.037〕與IS的發(fā)生密切相關(guān)，表明等位基因C可作為IS的一個(gè)保護(hù)因素。Ben Assaya等[18]探討rs3093059多態(tài)性與頸總動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度相關(guān)性，多因素分析表明，rs3093059等位基因C與冠狀動(dòng)脈造影(CCA)內(nèi)膜中層厚度(IMT)亦有關(guān)〔OR=1.74，95%CI(1.11，2.77)，P=0.002〕。

GAS6是維生素K依賴蛋白家族的一員，可與其受體酪氨酸激酶家族(包括Axl、Sky、 Mer)結(jié)合，參與炎癥反應(yīng)[19-20]、血小板聚集[21-22]和動(dòng)脈粥樣硬化[23-24]等IS發(fā)病機(jī)制的發(fā)生。rs7400722:C>T位于內(nèi)含子區(qū)，推測(cè)該SNP位點(diǎn)可能引起剪切位點(diǎn)改變，繼而影響轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后加工等過(guò)程，導(dǎo)致編碼GAS6的蛋白質(zhì)功能異?；蚧钚愿淖僛25]，進(jìn)而影響血小板活化和動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程，最終促進(jìn)IS的發(fā)生。筆者先前的研究結(jié)果顯示rs7400722:C>T與IS及其亞型的發(fā)生均無(wú)相關(guān)性[26]。在本研究中，通過(guò)GMDR分析，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與rs3093059:T>C存在交互作用，推測(cè)CRP和GAS6二者可能共同參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，共同導(dǎo)致了IS的發(fā)生。

此外，本研究亦存在一定的不足。首先，樣本量小，論證強(qiáng)度較低；其次，僅對(duì)4個(gè)常見(jiàn)的SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，未對(duì)其他與IS相關(guān)的候選基因進(jìn)行研究；最后，所選SNP并不能完全代表整個(gè)基因，下一步仍需結(jié)合人類HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)選擇多個(gè)SNP標(biāo)簽。

綜上所述， rs3093059:T>C與rs7400722:C>T之間存在交互作用，隱性模型rs3093059 TC+CC可能協(xié)同rs7400722 CT+TT增加了LAA的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，CRP和GAS6基因可能共同影響了IS的易患性。

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