新城疫病毒毒力分子機(jī)制研究進(jìn)展

于 洋， 封 振， 何孔旺， 仇旭升， 丁 鏟

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室，國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210014;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，國家家禽工程技術(shù)研究中心，上海 200241;3.江蘇出入境檢驗檢疫局動植食中心，江蘇 南京 210001)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一種能夠感染家禽的烈性傳染病，由于NDV的廣泛傳播性，給世界養(yǎng)禽業(yè)成了巨大的損失［1-2］。NDV屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus)，與肺炎病毒亞科一起構(gòu)成了副粘病毒科。NDV只有一個血清型，根據(jù)其長度分為Class I和Class II 2大系譜，Class I譜系包含了15 198 nt基因組長度的所有病毒，Class II譜系包含了15 186 nt和15 192 nt 2種基因組長度的病毒。NDV基因組含有6個開放式閱讀框(ORF)，分別編碼核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸蛋白(HN)和大蛋白(L)。此外，在P基因轉(zhuǎn)錄過程中由于RNA編輯作用產(chǎn)生V和W 2種非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)［3］。

NDV主要通過呼吸道感染，由于病毒株致病力的差異可以引起不同臨床癥狀，所以根據(jù)其疾病的嚴(yán)重程度，又可將NDV劃分為3個致病型:緩發(fā)型病毒株、中發(fā)型病毒株與嗜內(nèi)臟和神經(jīng)的速發(fā)型病毒株。其中緩發(fā)型病毒株僅能引起溫和或者不明顯的呼吸道癥狀;中發(fā)型病毒株能夠產(chǎn)生中等死亡率的呼吸道和神經(jīng)癥狀，但只有腦內(nèi)接種時才能使雞嚴(yán)重發(fā)病和死亡;嗜內(nèi)臟和神經(jīng)的速發(fā)型毒株則可以導(dǎo)致嚴(yán)重的腸胃損傷和神經(jīng)性癥狀，造成較高致死率，在雞群中其致死率甚至可以達(dá)到100%［4］。

NDV毒力是由多種遺傳因素決定，這其中可能涉及到病毒的組織嗜性、應(yīng)對宿主免疫系統(tǒng)能力和其自身復(fù)制效率等多因素的影響。迄今為止，關(guān)于毒力因子的定義以及毒力的決定因素尚未明確。目前對毒力的研究大多是集中在利用反向遺傳平臺對某個基因進(jìn)行突變、替換或者將某個基因完全敲除，觀察其是否可以導(dǎo)致毒力的變化，從而確定相關(guān)基因或者氨基酸序列是否與病毒的毒力相關(guān)。隨著反向遺傳技術(shù)的成熟，關(guān)于NDV病毒基因和蛋白質(zhì)在病毒復(fù)制周期的作用及其毒力的研究已有廣泛報道。本文著重從不同方面闡述NDV病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄過程以及與病毒毒力相關(guān)的一些重要因素。

1 NDV毒力的評價指標(biāo)

一直以來，對于毒力評價的體內(nèi)試驗主要是雞胚平均死亡時間(MDT)、六周齡雞靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)以及一日齡雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)。根據(jù)OIE標(biāo)準(zhǔn)，速發(fā)型毒株的MDT值為40～60 h，中發(fā)型為60～90 h，而緩發(fā)型為大于90 h(一般4～5 d);IVPI指標(biāo)，速發(fā)型為大于1，中發(fā)型為0～0.8、緩發(fā)型為0;速發(fā)型ICPI指標(biāo)為1.6～2.5，中發(fā)型為0.6 ～1.5，緩發(fā)型為 0 ～0.5［5］。盡管在大部分情況下，MDT和IVPI可以對毒力進(jìn)行有效的表述，但是卻不夠精確，尤其是在評估宿主(除了雞以外)體內(nèi)分離到的病毒時，其劣勢就更加明顯了。因此當(dāng)爆發(fā)疑似疫情時，評價NDV分離株的特性，就需要使用較為精確、敏感的ICPI指標(biāo)來進(jìn)行描述。

2 NDV的侵入機(jī)制與毒力

NDV感染過程是通過病毒粘附到靶細(xì)胞表面從而啟動的，首先病毒的HN糖蛋白需要結(jié)合細(xì)胞表面的唾液酸受體，通過不依賴于pH的機(jī)制觸發(fā)病毒囊膜上的F蛋白與細(xì)胞膜的融合;隨后被NP蛋白衣殼化的RNA基因組與P和L蛋白形成的聚合酶復(fù)合體一起構(gòu)成病毒的核糖核蛋白質(zhì)復(fù)合體(RNP)［6］;當(dāng)RNP進(jìn)入細(xì)胞后，病毒的核衣殼與M蛋白質(zhì)分離，釋放進(jìn)入胞質(zhì)中，而后聚合酶復(fù)合體轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA，從而產(chǎn)生病毒蛋白質(zhì)合成所需的mRNA。在此過程中，聚合酶復(fù)合體與核衣殼的結(jié)合，不僅需要P蛋白的介導(dǎo)［7］，還需要 L蛋白的催化活性［8］。當(dāng)足夠量的病毒蛋白聚集完成后，病毒便開始了由基因組轉(zhuǎn)錄過程到復(fù)制過程的切換。由于聚合酶復(fù)合物能夠反過來作為負(fù)鏈基因組RNA合成的模板從而發(fā)揮其生物學(xué)功能，因此它對于正鏈反義基因組RNA的合成起到了至關(guān)重要的作用。通過NP蛋白與新產(chǎn)生的基因組RNA以及多聚酶復(fù)合物的結(jié)合，病毒的核衣殼發(fā)生聚集。病毒粒子的所有組份被運(yùn)輸?shù)搅思?xì)胞膜，隨后在細(xì)胞膜上的M蛋白的指導(dǎo)下進(jìn)行組裝，最后子代病毒體便可以通過出芽的方式從細(xì)胞中進(jìn)行釋放［9］。

像許多有囊膜的病毒一樣，NDV在進(jìn)入宿主細(xì)胞時，需要通過胞內(nèi)或胞外蛋白酶的裂解從而實現(xiàn)病毒F蛋白的激活。有報道認(rèn)為NDV弱毒株在細(xì)胞間的擴(kuò)散以及在單層細(xì)胞上形成合胞體，需要外源性胰蛋白酶的輔助才能實現(xiàn)，而強(qiáng)毒則不然，由此表明NDV的蝕斑形成過程與毒力是相關(guān)的［10］。前體糖蛋白F0在宿主細(xì)胞胰蛋白酶的作用下，裂解成F1和F2，這個過程對形成有感染性的子代病毒是必不可少的［11］。而病毒糖蛋白的激活則需要通過能識別單個或者多個堿性裂解位點的蛋白酶介導(dǎo)［12］，緩發(fā)型NDV的F蛋白裂解位點存在有一個單一的堿性氨基酸基序(112GR/KQGR↓L117)，通過呼吸道和腸道內(nèi)的類胰蛋白酶，進(jìn)行細(xì)胞外裂解。而中發(fā)型和速發(fā)型NDV的F蛋白裂解位點則存在多個堿性氨基酸基序(112R/G/KRQ/KK/RR↓F117)，能夠在細(xì)胞外被廣泛存在的弗林樣蛋白酶裂解，所以在全身性感染過程中造成了極高的致死率［13-15］。這表明病毒在動物體內(nèi)的復(fù)制是嚴(yán)格依賴于病毒的蛋白質(zhì)水解活性。因此，F(xiàn)蛋白裂解位點的氨基酸序列被認(rèn)為是新城疫病毒的主要決定因子［13，16］。

在病毒入侵過程中另一個重要的蛋白質(zhì)是HN，它可以促使病毒粒子與細(xì)胞表面的唾液酸受體的粘附，并能夠在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞過程中激活F蛋白的融合活性。此外，HN蛋白的神經(jīng)氨酸酶活性不僅有利于病毒與細(xì)胞的分離，而且為中和子代病毒上的唾液酸殘基，進(jìn)而為阻止子代病毒的自我聚集發(fā)揮了重要的作用［12］。對過去50年分離的NDV毒株進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)HN基因有4種不同的氨基酸長度，分別為 571 aa、577 aa、581 aa、616 aa。其中 616 aa 的HN基因主要出現(xiàn)在一些緩發(fā)型的病毒株中，如Queensland、Ulster和D26毒株，該長度的HN蛋白以一種前體形式存在，需要經(jīng)過蛋白酶水解過程從而切除C末端一小段糖基化的堿基才能發(fā)揮其活性［17］;而其他3種長度的HN蛋白，都是以活化的形式存在于速發(fā)型毒株中。雖然有報道證實HN的開放式閱讀框(ORF)長度對于病毒毒力沒有任何關(guān)聯(lián)，但由于F蛋白質(zhì)和HN蛋白在病毒體外膜上是緊密關(guān)聯(lián)的，而且研究結(jié)果表明F蛋白的蛋白酶水解活性和病毒的毒力也存在著重要的關(guān)系，所以HN前體的加工可能會影響到毒力的變化［18］。

在病毒生命周期中，病毒蛋白質(zhì)自身的糖基化對其病毒株的適應(yīng)性是至關(guān)重要的。有研究表明通過對HN蛋白N端結(jié)合的糖基化位點的修飾可以降低NDV毒力［19］，因為在NDV的HN蛋白中，大多數(shù)的糖基化位點是相當(dāng)保守的，他們在蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能中起著重要的作用。

3 NDV的復(fù)制與毒力

在許多病毒中，病毒的毒力與病毒的復(fù)制效率存在著密切的關(guān)系。盡管這種聯(lián)系并沒有得到完全的解釋，但有足夠的理由可以認(rèn)為，高水平的病毒復(fù)制可以產(chǎn)生更多的病毒產(chǎn)物，進(jìn)而抑制宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致致病性的增強(qiáng)。有研究表明，NDV的RNA合成水平的降低與其毒力的下降是有關(guān)聯(lián)的［20］。對麻疹病毒，呼吸道合胞體病毒、副流感病毒的研究結(jié)果表明，病毒毒力的弱化與復(fù)制復(fù)合體組份的突變也具有相關(guān)性［21-22］。而對流感病毒而言，病毒聚合酶蛋白PB2和PA被認(rèn)為對于毒力是有影響的［23］。當(dāng)對鴿Ⅰ副黏病毒株(PPMV-1)在雞腦中連續(xù)傳代后出現(xiàn)的優(yōu)勢病毒株進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，這些突變恰恰導(dǎo)致了病毒在體內(nèi)、外的高效復(fù)制［24］。此外，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信號也可能會通過病毒調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)從而影響毒力。有研究表明，構(gòu)成病毒復(fù)制復(fù)合體(NP、P、L)的3種蛋白質(zhì)基因，會表現(xiàn)出一種協(xié)同效應(yīng)，這對NDV毒力也能起到?jīng)Q定性的作用［20］。

與此同時病毒的基質(zhì)蛋白(M)也被認(rèn)為是一種在病毒復(fù)制過程發(fā)揮重要作用的調(diào)控蛋白。M蛋白主導(dǎo)著病毒的形態(tài)發(fā)生和出芽過程，同時它通過與復(fù)制復(fù)合體的互作，進(jìn)而影響著病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制［25］。由于M蛋白與核衣殼有著密切的關(guān)聯(lián)，所以NP蛋白可能對病毒出芽起到了協(xié)同蛋白質(zhì)的作用。由于病毒進(jìn)入靶細(xì)胞后，核衣殼會從M蛋白上分離，并且被釋放進(jìn)入胞質(zhì)，為轉(zhuǎn)錄做準(zhǔn)備。因此，M蛋白與核衣殼的相互作用將可能會影響到病毒的轉(zhuǎn)錄從而進(jìn)一步影響著病毒的復(fù)制過程。而在病毒感染周期中，M蛋白在胞質(zhì)和核之間運(yùn)輸，或許也表明，M蛋白在核中的存在，可能會抑制宿主細(xì)胞的功能［26］。

4 NDV的免疫逃避機(jī)制與毒力

病毒在感染機(jī)體的過程中，主要表現(xiàn)在對細(xì)胞的侵占和破壞，最終無論是以怎樣的方式利用細(xì)胞來實現(xiàn)自身的復(fù)制，都會對機(jī)體產(chǎn)生損傷。因此對于動物機(jī)體而言，為了抵御病毒的侵入，就必須通過免疫系統(tǒng)來實現(xiàn)對入侵病毒的清除和消滅。

對于副粘病毒而言，當(dāng)其感染細(xì)胞后，會誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生干擾素(IFN)并引起細(xì)胞的凋亡，從而來抵御病毒的侵入，而IFN系統(tǒng)則是宿主抵御病毒感染的第一條防線。當(dāng)干擾素誘導(dǎo)抗病毒反應(yīng)時，能夠抑制病毒的復(fù)制和控制病毒的擴(kuò)散。副粘病毒有一種阻斷IFN產(chǎn)物和IFN敏感的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，從而逃避或者對抗宿主自身的先天性免疫應(yīng)答［27］。許多副粘病毒IFN逃避活性是通過病毒編碼的V蛋白介導(dǎo)的，除了人副流感病毒1型(HPIV-1)缺乏一個完整的V蛋白ORF外，V蛋白在其他副粘病毒中均具有保守性。NDV的V蛋白是基于多順反子的P基因，在P基因的轉(zhuǎn)錄過程中，在保守的編輯位點插入一個或者2個G，從而產(chǎn)生完整的3個基于P基因的mRNA，其mRNA編碼未編輯的P基因的ORF(V ORF和W ORF)［28］。NDV和許多其他的副粘病毒的V蛋白C末端的半胱氨酸富集區(qū)都存在著IFN拮抗活性，在個別副粘病毒，這也是一個高度保守的區(qū)域［29］。最近研究結(jié)果表明，STAT-1蛋白質(zhì)是一種IFN信號蛋白質(zhì)，他能夠與其他細(xì)胞因子相作用，從而形成干擾素刺激基因(ISG)表達(dá)所必須的ISG轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，而NDV V蛋白C末端，能夠誘導(dǎo)STAT-1蛋白質(zhì)的降解，在NDV感染過程中，STAT-1的降解可能是一種ISG轉(zhuǎn)錄沉默的重要機(jī)制［30］。

5 NDV的非編碼區(qū)基序與毒力

有研究結(jié)果表明，在麻疹病毒和犬瘟熱病毒中，M基因3'UTR和F基因的5'UTR在病毒的復(fù)制和毒力中起到了很重要的作用［31］;而在NP基因的5'UTR插入6 nt，恰好使得NDV Class II型病毒分成了基因長度為15 186 nt和15 192 nt的2個組;對這2個組包含的致病性的病毒進(jìn)行研究，結(jié)果表明插入的6 nt在毒力中并不起主要作用［32］。

當(dāng)去除HN基因整個5'UTR能夠影響到HN mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯甚至于病毒的毒力［33］。每個UTR對于基因和與他關(guān)聯(lián)的基因的特殊位置都存在著特定長度的基因間隔序列(IGSs)，即轉(zhuǎn)錄終止區(qū)和轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)之間的核苷酸數(shù)目，F(xiàn)、HN、L 3個連續(xù)基因間的IGSs是存在差異的，分別為31 nt和47 nt。研究結(jié)果表明，盡管NDV能夠耐受至少365 nt的IGSs長度，但是延長IGSs的長度會下調(diào)下游基因的轉(zhuǎn)錄;延長或者縮短IGSs長度的病毒都會導(dǎo)致病毒致病力的減弱［34］，這也許可以證明基因修飾會對毒力的變化產(chǎn)生影響。NDV的IGSs和UTRs長度是相對保守的，而這些區(qū)域的核苷酸序列可能在一定程度上有差異，這對于非編碼區(qū)是必然的。對于基因組區(qū)域的序列和NDV毒株毒力的自然演化機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

6 小結(jié)

越來越多的研究已經(jīng)證實，病毒的毒力是一個由多基因共同決定的復(fù)雜過程。對于NDV而言，F(xiàn)蛋白多個堿性氨基酸裂解位點基序是決定毒力的主要因素。此外，基于反向遺傳的眾多研究，我們發(fā)現(xiàn)NP、P、V、M、HN、L蛋白都對毒力起到了一定的作用，但是這些基因?qū)Χ玖Φ挠绊憛s很可能僅僅依賴于某個試驗所選用的特定病毒株。其次，使用公認(rèn)的ICPI指標(biāo)參數(shù)進(jìn)行毒力判定，其敏感性的不足會忽略很多微弱的病毒株間的差異，此外ICPI的感染途徑是人工接種方式，所以此參數(shù)獲得的結(jié)果與自然途徑所獲得的結(jié)果間的一致性值得我們思考。

關(guān)于NDV調(diào)控組織嗜性、轉(zhuǎn)錄和翻譯的分子機(jī)制，以及它是怎么樣突破宿主防御，影響毒力的機(jī)制依然存在許多疑問。對于決定NDV毒力的分子機(jī)制的研究，還有待進(jìn)一步的研究。

［1］BANERJEE M，REED W M，F(xiàn)ITZGERALD S D，et al.Neurotropic velogenic Newcastle disease in cormorants in Michigan:pathology and virus characterization［J］.Avian Dis，1994，38:873-878.

［2］周廣生，周新民，羊建平，等.中藥口服液防治雞新城疫的試驗研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(4):239-240.

［3］STEWARD M，VIPOND I B，MILLAR N S，et al.RNA editing in Newcastle disease virus［J］.J Gen Virol，1993，74(12):2539-2547.

［4］ALEXANDER D J.Newcastle disease and other avian paramyxoviruses［J］.Rev Sci Tech，2000，19:443-462.

［5］OIE.哺乳動物、禽和蜜蜂A和B類疾病診斷試驗和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，1996.

［6］HORIKAMI S M，CURRAN J，KOLAKOFSKY D，et al.Complexes of Sendai virus NP-P and P-L proteins are required for defective interfering particle genome replication in vitro［J］.J Virol，1992，66:4901-4908.

［7］CURRAN J.Reexamination of the Sendai virus P protein domains required for RNA synthesis:a possible supplemental role for the P protein［J］.Virology，1996，221:130-140.

［8］SIDHU M S，MENONNA J P，COOK S D，et al.Canine distemper virus L gene:sequence and comparison with related viruses［J］.Virology，1993，193:50-65.

［9］HARRISON M S，SAKAGUCHI T，SCHMITT A P.Paramyxovirus assembly and budding:Building particles that transmit infections［J］.International Journal of Biochemistry＆ Cell Biology，2010，42:1416-1429.

［10］LI Z，SERGEL T，RAZVI E，et al.Effect of cleavage mutants on syncytium formation directed by the wild-type fusion protein of Newcastle disease virus［J］.J Virol，1998，72:3789-3795.

［11］ROMER-OBERDORFER A，VEITS J，WERNER O，et al.Enhancement of pathogenicity of Newcastle disease virus by alteration of specific amino acid residues in the surface glycoproteins F and HN［J］.Avian Dis，2006，50:259-263.

［12］TAKIMOTO T，PORTNER A.Molecular mechanism of paramyxovirus budding［J］.Virus Res，2004，106:133-145.

［13］OGASAWARA T，GOTOH B，SUZUKI H，et al.Expression of factor X and its significance for the determination of paramyxovirus tropism in the chick embryo［J］.EMBO J，1992，11:467-472.

［14］FUJII Y，SAKAGUCHI T，KIYOTANI K，et al.Comparison of substrate specificities against the fusion glycoprotein of virulent Newcastle disease virus between a chick embryo fibroblast processing protease and mammalian subtilisin-like proteases［J］.Microbiol Immunol，1999，43:133-140.

［15］SAMAL S，KUMAR S，KHATTAR S K，et al.A single amino acid change，Q114R，in the cleavage-site sequence of Newcastle disease virus fusion protein attenuates viral replication and pathogenicity［J］.J Gen Virol，2011，92:2333-2338.

［16］PEETERS B P，DE LEEUW O S，KOCH G，et al.Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA:evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence［J］.J Virol，1999，73:5001-5009.

［17］LI Y，COLLINS M S，WHITELAM G C，et al.Rapid pathotyping of Newcastle disease virus using a single-chain Fv displayed on phage against the C-terminal end of the F2 polypeptide［J］.Arch Virol，2002，147:2025-2037.

［18］ROMER-OBERDORFER A，WERNER O，VEITS J，et al.Contribution of the length of the HN protein and the sequence of the F protein cleavage site to Newcastle disease virus pathogenicity［J］.J Gen Virol，2003，84:3121-3129.

［19］PANDA A，ELANKUMARAN S，KRISHNAMURTHY S，et al.Loss of N-linked glycosylation from the hemagglutinin-neuraminidase protein alters virulence of Newcastle disease virus［J］.J Virol，2004，78:4965-4975.

［20］DORTMANS J C，ROTTIER P J，KOCH G，et al.The viral replication complex is associated with the virulence of Newcastle disease virus［J］.J Virol，2010，84:10113-10120.

［21］BANKAMP B，KEARNEY S P，LIU X，et al.Activity of polymerase proteins of vaccine and wild-type measles virus strains in a minigenome replication assay［J］.J Virol，2002，76:7073-7081.

［22］MURPHY B R，COLLINS P L.Live-attenuated virus vaccines for respiratory syncytial and parainfluenza viruses:applications of reverse genetics［J］.J Clin Invest，2002，110:21-27.

［23］SALOMON R，F(xiàn)RANKS J，GOVORKOVA E A，et al.The polymerase complex genes contribute to the high virulence of the human H5N1 influenza virus isolate A/Vietnam/1203/04［J］.J Exp Med，2006，203:689-697.

［24］DORTMANS J C，ROTTIER P J，KOCH G，et al.Passaging of a Newcastle disease virus pigeon variant in chickens results in selection of viruses with mutations in the polymerase complex enhancing virus replication and virulence［J］.J Gen Virol，2011，92:336-345.

［25］LI D，JANS D A，BARDIN P G，et al.Association of respiratory syncytial virus M protein with viral nucleocapsids is mediated by the M2-1 protein［J］.J Virol，2008，82:8863-8870.

［26］AHMED M，MCKENZIE M O，PUCKETT S，et al.Ability of the matrix protein of vesicular stomatitis virus to suppress beta interferon gene expression is genetically correlated with the inhibition of host RNA and protein synthesis［J］.J Virol，2003，77:4646-4657.

［27］FONTANA J M，BANKAMP B，ROTA P A.Inhibition of interferon induction and signaling by paramyxoviruses［J］.Immunol Rev，2008，225:46-67.

［28］YUSOFF K，TAN W S.Newcastle disease virus:macromolecules and opportunities［J］.Avian Pathol，2001，30:439-455.

［29］RAMACHANDRAN A，HORVATH C M.Paramyxovirus disruption of interferon signal transduction:STATus report［J］.J Interferon Cytokine Res，2009，29:531-537.

［30］HUANG Z，KRISHNAMURTHY S，PANDA A，et al.Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis and functions as an alpha interferon antagonist［J］.J Virol，2003，77:8676-8685.

［31］ANDERSON D E，VON M V.Region between the canine distemper virus M and F genes modulates virulence by controlling fusion protein expression［J］.J Virol，2008，82:10510-10518.

［32］CZEGLEDI A，UJVARI D，SOMOGYI E，et al.Third genome size category of avian paramyxovirus serotype 1(Newcastle disease virus)and evolutionary implications［J］.Virus Res，2006，120:36-48.

［33］YAN Y，ROUT S N，KIM S H，et al.Role of untranslated regions of the hemagglutinin-neuraminidase gene in replication and pathogenicity of Newcastle disease virus［J］.J Virol，2009，83:5943-5946.

［34］YAN Y，SAMAL S K.Role of intergenic sequences in Newcastle disease virus RNA transcription and pathogenesis［J］.J Virol，2008，82:1323-1331.