一氧化氮對(duì)萵苣種子萌發(fā)過(guò)程中部分物質(zhì)代謝的影響

楊北寧， 張鳳芝， 蘇國(guó)興

(蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

迄今為止，已有大量有關(guān)一氧化氮(NO)促進(jìn)植物種子萌發(fā)的報(bào)道［1］。Kopyra等在羽扇豆(Lupinus luteus)中發(fā)現(xiàn)，一定濃度的NO供體硝普鈉(SNP)可提高種子萌發(fā)率，作用效果與時(shí)間有關(guān)，48 h后SNP這種促進(jìn)萌發(fā)作用消失［2］。Lamatine等報(bào)道，在26℃條件下，SNP能夠明顯地促進(jìn)處于暗處的萵苣種子萌發(fā)，而用NO清除劑cPTIO處理則可降低對(duì)萌發(fā)的促進(jìn)作用［3］。外源添加一定濃度SNP可明顯提高豌豆、黃瓜、玉米和刺槐種子的發(fā)芽率［4］。Sarath等證實(shí)，NO供體SNP、亞鐵氰化鉀和CN－同樣可促進(jìn)2種溫季牧草種子的萌發(fā)，并可被NO清除劑cPTIO抑制，而認(rèn)定在該種子萌發(fā)過(guò)程中有NO的產(chǎn)生［5］。近年來(lái)，隨著NO在植物種子萌發(fā)和休眠中所起作用的確定，人們相繼展開(kāi)了NO促進(jìn)種子萌發(fā)和解除休眠的機(jī)理研究。如在擬南芥種子萌發(fā)過(guò)程中，證實(shí)NO的作用部位是糊粉層。在NO外源供體SNP誘導(dǎo)小麥種子萌發(fā)的研究中，發(fā)現(xiàn)種子的β-淀粉酶基因轉(zhuǎn)錄水平和β-淀粉酶活性受到SNP的促進(jìn)［6］。然而，經(jīng)NO和NO合成抑制劑處理后，在種子萌發(fā)過(guò)程中，種子內(nèi)貯藏物質(zhì)含量的變化仍鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以萵苣種子為材料，研究NO供體硝普鈉(SNP)和NO生物合成抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)對(duì)萵苣種子萌發(fā)時(shí)內(nèi)含物質(zhì)含量和水解酶活性的影響，為NO供體促進(jìn)萵苣種子萌發(fā)時(shí)物質(zhì)代謝變化的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

萵苣(Lactuca sativa L.)品種掛絲紅種子購(gòu)于四川省綿陽(yáng)市種都種業(yè)有限公司。所有藥品均購(gòu)自Sigma公司。

萵苣種子先用0.5%的HgCl2消毒5 min，再用無(wú)菌水沖洗5次后，在22℃黑暗環(huán)境中用處理液浸種4 h，處理液濃度如下:(1)0 mmol/L(對(duì)照)、0.05 mmol/L、0.10 mmol/L、0.20 mmol/L NO 供體 SNP;(2)1.00 mmol/L NO生物合成抑制劑L-NAME，所有處理液pH 5.8。選取飽滿(mǎn)的種子播種于含0.5%瓊脂的固體培養(yǎng)基上，22℃暗培養(yǎng)。每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2 測(cè)定方法

用目測(cè)法(胚根突破種皮大于1 mm)測(cè)定0 mmol/L、0.05 mmol/L、0.10 mmol/L、0.20 mmol/L SNP處理48 h萵苣種子的萌發(fā)率及0 mmol/L、0.10 mmol/L SNP和1.00 mmol/L L-NAME分別處理12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 萵苣種子的種子萌發(fā)率。測(cè)定0 mmol/L、0.10 mmol/L SNP 和 1.00 mmol/L LNAME 分別處理12 h、24 h、36 h、48 h 萵苣種子內(nèi)含物質(zhì)含量和水解酶活性:粗脂肪索氏提取法測(cè)定粗脂肪含量［7］;蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖和淀粉含量［8］;考馬斯亮藍(lán) G250 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量［8］;3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定α-淀粉酶和β-淀粉酶活性［8］;堿式滴定法測(cè)定脂肪酶活性［9］;磺胺法測(cè)定硝酸還原酶活性［10］。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用Duncan’s法比較差異顯著性。應(yīng)用EXCEL軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度硝普鈉(SNP)對(duì)萵苣種子萌發(fā)的影響

用不同濃度SNP處理萵苣種子36 h，種子的萌發(fā)率如圖1所示。SNP對(duì)萵苣種子的萌發(fā)表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用，在0～0.10 mmol/L濃度范圍內(nèi)，種子萌發(fā)率隨SNP濃度的增加而升高，當(dāng)SNP濃度為0.10 mmol/L時(shí)，種子萌發(fā)率最高;而當(dāng)SNP的濃度增至0.20 mmol/L時(shí)，種子萌發(fā)受到明顯抑制。表明0.10 mmol/L SNP促進(jìn)萵苣種子萌發(fā)的效果最佳。

圖1 不同濃度硝普鈉對(duì)萵苣種子萌發(fā)的影響Fig.1 The effect of different concentrations of SNP on the seed germination of lettuce

2.2 0.10 mmol/L硝普鈉(SNP)和1.00 mmol/L N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)對(duì)萵苣種子萌發(fā)的影響

在浸種12～36 h，0.10 mmol/L SNP處理對(duì)種子萌發(fā)的促進(jìn)作用最為顯著，在浸種處理24 h和36 h時(shí)，種子萌發(fā)率分別比對(duì)照增加26.5個(gè)百分點(diǎn)(P＜0.05)和15.5個(gè)百分點(diǎn)(P＜0.05)，但浸種處理48 h后這種促進(jìn)作用逐漸減弱。1.00 mmol/L LNAME浸種則可顯著抑制種子的萌發(fā)，在浸種36 h時(shí)，萌發(fā)率僅28.1%(圖2)。

圖2 0.10 mmol/L 硝普鈉和 1.00 mmol/L N-硝基-L-精氨酸甲酯對(duì)萵苣種子萌發(fā)的影響Fig.2 The effect of 0.10 mmol/L SNP and 1.00 mmol/L LNAME on the seed germination of lettuce

2.3 硝普鈉(SNP)和 N-硝基-L-精氨酸甲酯(LNAME)對(duì)萵苣種子萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)含物質(zhì)含量的影響

如表1所示，0.10 mmol/L SNP處理下萵苣種子的粗脂肪含量和蛋白質(zhì)含量均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，與0 mmol/L SNP處理(對(duì)照)相比，差異均不顯著(P＞0.05));0.10 mmol/L SNP處理下萵苣種子的淀粉含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，均顯著低于0 mmol/L SNP處理(對(duì)照)(P＜0.05);0.10 mmol/L SNP處理下萵苣種子的可溶性糖含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，均顯著高于0 mmol/L SNP處理(對(duì)照)(P＜0.05)。

表1 0.10 mmol/L SNP對(duì)萵苣種子萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)含物質(zhì)含量的影響Table 1 The effects of 0.10 mmol/L SNP on some substance contents of lettuce during seed germination

如表2所示，1.00 mmol/L L-NAME處理下萵苣種子的蛋白質(zhì)含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，與0 mmol/L SNP處理(對(duì)照)相比，差異均不顯著(P＞0.05);1.00 mmol/L L-NAME處理下萵苣種子的粗脂肪含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，處理36 h和48 h的粗脂肪含量均顯著高于0 mmol/L SNP處理(對(duì)照)(P＜0.05);1.00 mmol/L L-NAME處理下萵苣種子的淀粉含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，均顯著高于0 mmol/L SNP處理(對(duì)照)(P＜0.05);0.10 mmol/L SNP處理下萵苣種子的可溶性糖含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，均顯著低于0 mmol/L SNP處理(對(duì)照)(P＜0.05)。

表2 1.00 mmol/L L-NAME對(duì)萵苣種子萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)含物質(zhì)含量的影響Table 2 The effects of 1.00 mmol/L L-NAME on some substance contents during lettuce seed germination

2.4 硝普鈉(SNP)和 N-硝基-L-精氨酸甲酯(LNAME)處理后部分水解酶活性的變化

如圖3所示，不同處理下萵苣種子萌發(fā)過(guò)程中α-淀粉酶活性均隨種子處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，其中0.10 mmol/L SNP處理的α-淀粉酶活性顯著高于0 mmol/L SNP處理(對(duì)照)(P＜0.05);0 mmol/L SNP處理下β-淀粉酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在處理36 h時(shí)β-淀粉酶活性均達(dá)到最高峰，0.10 mmol/L SNP處理的β-淀粉酶活性顯著高于0 mmol/L SNP處理(對(duì)照)(P＜0.05);不同處理下萵苣種子萌發(fā)過(guò)程中脂肪水解酶活性均隨種子處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，在浸種12～48 h 0.10 mmol/L SNP處理的種子脂肪水解酶活性均顯著高于0 mmol/L SNP(對(duì)照)處理(P＜0.05);不同處理下萵苣種子萌發(fā)過(guò)程中硝酸還原酶活性均隨種子處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，在浸種12～36 h 0.10 mmol/L SNP處理的種子硝酸還原酶活性均顯著高于0 mmol/L SNP(對(duì)照)處理(P＜0.05)。在浸種12～36 h 1.00 mmol/L L-NAME處理的 α-淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪水解酶、硝酸還原酶的活性均顯著低于0 mmol/L SNP(對(duì)照)和0.10 mmol/L SNP處理(P ＜0.05)。

圖3 萵苣種子萌發(fā)過(guò)程中部分水解酶活性的變化Fig.3 The changes of some hydrolases activities during seed germination of lettuce

3 討論

一氧化氮在植物體的多種生理過(guò)程中有重要作用。從本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，0 mmol/L、0.05 mmol/L和0.10 mmol/L硝普鈉(SNP)對(duì)萵苣種子的萌發(fā)表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用，其中0.10 mmol/L硝普鈉的促進(jìn)作用好于其他2種處理，當(dāng)SNP濃度上升到0.20 mmol/L時(shí)種子萌發(fā)受到顯著抑制;在浸種12～36 h，0.10 mmol/L SNP對(duì)種子萌發(fā)的促進(jìn)作用最為顯著，48 h后作用消失。這與白旭等［10］關(guān)于SNP促進(jìn)萵苣種子萌發(fā)的研究結(jié)果相一致。

Bethke等指出，NO促進(jìn)種子的萌發(fā)可能與種子對(duì)脫落酸和赤霉素的敏感性改變有關(guān)［11］，而ABA和GA與種子水解酶的誘導(dǎo)合成和活性調(diào)節(jié)有關(guān)。孫永剛等在NO外源供體SNP誘導(dǎo)小麥種子萌發(fā)的研究中，發(fā)現(xiàn)種子的β-淀粉酶基因轉(zhuǎn)錄水平和β-淀粉酶活性受到SNP的促進(jìn)［12］，這暗示在種子萌發(fā)過(guò)程中，種子內(nèi)含物質(zhì)的變化會(huì)受到NO的影響。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)0.10 mmol/L SNP浸種，雖可對(duì)種子蛋白質(zhì)和粗脂肪含量的下降有一定的促進(jìn)作用，但效果不顯著;而0.10 mmol/LSNP浸種可顯著降低淀粉和增加可溶性糖含量。用抑制種子萌發(fā)的NO生物合成抑制劑1.00 mmol/L L-NAME浸種，同樣發(fā)現(xiàn)，它們對(duì)淀粉降解的抑制作用非常明顯，12 h后便觀察到可溶性糖含量的顯著下降，而1.00 mmol/L L-NAME對(duì)種子蛋白質(zhì)和粗脂肪含量的影響不大。這些結(jié)果與孫永剛等［12］的結(jié)果相符。

種子萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)含物質(zhì)的變化一般與種子內(nèi)水解酶活性的變化相對(duì)應(yīng)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)0.10 mmol/L SNP處理可顯著增加α-淀粉酶、硝酸還原酶和脂肪水解酶活性;β-淀粉酶活性雖在處理36 h時(shí)后呈逐漸下降趨勢(shì)，但前期(12～36 h)也明顯受SNP促進(jìn)。而用1.00 mmol/L L-NAME浸種，種子的α-淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪水解酶和硝酸還原酶活性均受到抑制。這些結(jié)果暗示，NO可能通過(guò)調(diào)節(jié)α-淀粉酶、β-淀粉酶、硝酸還原酶和脂肪酶等水解酶的活性，影響種子體內(nèi)貯藏物質(zhì)的降解，進(jìn)而影響萵苣種子萌發(fā)，其中，對(duì)淀粉降解和可溶性糖增加的促進(jìn)作用最為明顯。

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