福林酚衍生法檢測眼氨肽制劑的肽含量*

白海嬌，覃婷婷，高 翔

(1.天津藥品檢驗所，天津 300070； 2.天津市寧河縣藥品檢驗所，天津 301500)

眼氨肽制劑包括眼氨肽注射液及眼氨肽滴眼液，系以牛、羊或豬動物眼為原料，經(jīng)乙醇等工藝提取后制得的滅菌注射液或加適量的防腐劑經(jīng)無菌操作制成的滴眼液。該制劑含有多種氨基酸、多肽、核苷酸及微量元素等。眼氨肽注射液臨床上用于治療非化膿性角膜炎、玻璃體渾濁、鞏膜炎等；滴眼劑用于角膜炎、視力疲勞及青少年假性近視等眼疾。

1 儀器與試劑

使用日本島津2450紫外-可見分光光度儀；牛血清白蛋白對照品由SIGMA提供(批號103K1375)；氫氧化鈉、碳酸鈉、硫酸銅、酒石酸鉀均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1試劑配制

2．1．1堿性銅試液 取氫氧化鈉10 g和碳酸鈉50 g，加水400 ml使溶解，作為甲液；取酒石酸鉀0.5 g，加水50 ml，使其溶解，另取硫酸銅0.25 g，加水30 ml溶解，將兩液混合作為乙液。臨用前，合并甲、乙兩液，并加水至500 ml。

2．1.2對照品溶液的制備 精密稱取牛血清白蛋白對照品適量，加水溶解并稀釋成每1 ml中含0.3 mg/ml牛血清白蛋白的溶液，作為對照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備 精密量取本品適量，加水稀釋至肽含量約為0.1 mg/ml，作為供試品溶液。

2.2標準曲線制備 取對照品溶液0.0、0.1、0.3、0.5、0.7和0.9 ml，分別置具塞試管中，加水至2.0 ml，分別加入堿性銅試液1.0 ml，搖勻，各加入福林酚試液(福林試液1—16)4.0 ml，立即混勻，置55 ℃水浴中準確反應(yīng)5 min，置冷水浴10 min，在650 nm波長處測定吸收度；以0號管作為空白。以對照品溶液濃度為橫坐標，相應(yīng)的吸收度為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程：A= 5.1054C+0.0382(r=0.9992)，表明在0.0147～0.1325 mg/ml濃度范圍內(nèi)與吸收度呈良好的線性關(guān)系[1]。

2.3檢測方法 精密量取供試品溶液2.0 ml，照“2.2”項下方法測定，以回歸方程計算多肽的含量，計算即得。

2.4精密度試驗 精密吸取同一份供試品溶液，連續(xù)測定6次，測定吸收值并計算精密度，結(jié)果RSD為0.62%。

2.5重現(xiàn)性試驗 取同批眼氨肽注射液樣品，依“2.1.3”下方法制備6份樣品，照“2.3”項下方法檢測，并測定含量，結(jié)果多肽的平均含量為0.376 mg/ml，RSD為1.7%。

2.6回收率試驗 以加入法考查回收率，精密量取已知多肽含量的供試品溶液1.0 ml,分別精密加入濃度為0.044、0.074和0.103 mg/ml的對照品溶液1.0 ml，即分別相當于含量的60%、100%和180%，按“2.3”項下方法檢測，計算回收率。結(jié)果三個濃度的加樣回收率分別為98.6%、97.5%和98.7%，總回收率為98.3%(n=9)，RSD為1.9%。

表1 回收率試驗結(jié)果

2.7樣品測定結(jié)果 采用上述福林酚衍生方法分別對9個生產(chǎn)廠家52 批次眼氨肽注射液和4個生產(chǎn)廠家的30 批次眼氨肽滴眼液進行檢測，這些注射液和滴眼液分別抽自全國20個和14個省、自治區(qū)和直轄市，基本上可以代表市場上該品種的實際水平。結(jié)果見表2和表3。

表2 福林酚衍生法檢測眼氨肽注射液中多肽含量的結(jié)果

表3 福林酚衍生法檢測眼氨肽滴眼液中多肽含量的結(jié)果

3 討論

3.1眼氨肽制劑標準最早都收載在各地方標準中，最初時為眼生素注射液暫行標準，《中國藥典》及國外藥典均未收載；目前，標準收載于《國家藥品標準化學藥品地方標準上升國家標準》第九冊，缺少多肽檢測項目，小分子多肽是眼氨肽制劑的主要有效成分，但結(jié)果顯示大部分企業(yè)生產(chǎn)的樣品含多肽量均較少。

3.2實驗中同時采用氨基酸分析儀的方法檢測了兩種制劑中的水解氨基酸和多肽氨基酸，結(jié)果表明：福林酚法測定與氨基酸分析儀測定的結(jié)果有所差距，這是由于福林酚試劑顯色反應(yīng)是以牛血清白蛋白為對照，并且與溶液中的游離氨基酸，特別是苯丙氨酸和酪氨酸的含量相關(guān)。但分析后發(fā)現(xiàn)，各企業(yè)間福林酚法測定結(jié)果與水解氨基酸總量和多肽氨基酸總量的變化趨勢基本一致。

3.3調(diào)研工作發(fā)現(xiàn)，各企業(yè)的基本生產(chǎn)工藝均為原料處理→乙醇提取→濃縮→除蛋白→精制→制劑的過程，但各企業(yè)之間也有所差異，這是企業(yè)間多肽含量差異較大的原因。福林酚衍生方法和氨基酸分析儀方法檢測企業(yè)6生產(chǎn)的4批注射液，其肽含量均最高，考察該企業(yè)的生產(chǎn)工藝發(fā)現(xiàn)：其在精制工藝中加入了胃蛋白酶水解，然后進行過濾等步驟，這可能是注射液中多肽較高的原因。

1 中國藥典[S].二部.2010：附錄23