自身酶解水提取黃芩中黃芩素及漢黃芩素的方法

李曉燕，趙韶華，韓桂茹，安麗娜

(1．河北以嶺醫(yī)藥研究院，河北 石家莊 050035;2．河北省食品藥品檢驗院，河北 石家莊 050011;3．承德燕峰藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050091)

黃芩是一種常用中藥，為歷版中國藥典所收載品種，具清熱燥濕、瀉火解毒、止血，安胎之功效。黃芩中的有效成分主要有黃芩苷、漢黃芩苷及其苷元等黃酮類化合物[1]。而黃芩中的主苷元類，如黃芩素具有非常強的抗菌、抗病毒、抗炎，抗氧化及清除自由基、抗腫瘤及心血管保護等多種生物活性[2]。黃芩苷和黃芩素的大鼠胃、腸吸收動力學(xué)研究表明，黃芩素在各部位的吸收程度明顯高于黃芩苷，提示黃芩素具有廣泛的吸收窗[3]。雖然黃芩素具有上述諸多生物活性及吸收特點，但由于其制備技術(shù)的難度所限，很難進行規(guī)?；笊a(chǎn)，因此影響了該有效部位的新藥開發(fā)與臨床應(yīng)用。目前提取黃芩素的方法有自身酶解乙醇提取[4]、纖維素酶解法[5]、酸水解法[6]等，但都不同程度地采用外加試劑或酶的提取方法，長期應(yīng)用不利于環(huán)境保護。本研究中采用黃芩自身的酶，控制酶解條件，用水提取，以物理方法分離黃芩素和漢黃芩素，工藝經(jīng)濟環(huán)保，利于產(chǎn)業(yè)化。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀(Agilent 1100 series);紫外檢測器(VWD);電子恒溫水浴鍋(上海精宏)。黃芩藥材由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供;黃芩苷對照品(批號為110715-200514)、黃芩素對照品(批號為 110595-200604)、漢黃芩素對照品(批號為111514-200403)均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇(色譜純)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 黃芩素和漢黃芩素含量測定方法[7]

2．1．1 色譜條件

色譜柱:Agilent Zorbax-SB C18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm);流動相:甲醇-0．1%磷酸溶液(49∶51);流速:1 mL/min;檢測波長:275 nm;柱溫:30℃。

2．1．2 溶液制備

精密稱取黃芩素和漢黃芩素對照品適量，置棕色容量瓶中，分別加甲醇制成每1 mL含黃芩素30 μg、漢黃芩素10 μg的溶液，即得對照品溶液。取酶解后提取物10 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇20 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)10 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

方法學(xué)考察:經(jīng)考察，加樣回收試驗、重復(fù)性試驗、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗均符合要求。

2．2 酶解提取工藝

2．2．1 酶解溫度考察

取黃芩藥材，粗碎成0．5 cm以下的碎塊，按藥材質(zhì)量比，加9倍量水，在同一溫度下酶解提取2次，每次2 h，酶解溫度分別為35，45，55，60，65，70 ℃，濾取懸浮液，煮沸 10 min，冷卻，離心，收集沉淀，60℃烘干，即得黃芩苷元總提物。測定總提物中黃芩素、漢黃芩素的含量，結(jié)果見表1。酶解溫度在45～60℃之間，黃芩素和漢黃芩素的含量較高，70℃時有部分酶被破壞，黃芩素和漢黃芩素的含量有所下降，因此酶解的溫度應(yīng)控制在45～60℃。

表1 不同酶解溫度下提取黃芩提取物中黃芩素和漢黃芩素含量

2．2．2 酶解提取正交試驗

為篩選最佳的黃芩自身酶提取條件，選取了對提取物收率影響較大的提取次數(shù)(因素A)、提取時間(因素B)、加水量(因素C)、空白(因素D)為考察因素，藥材酌情碎斷成0．5 cm左右的小塊，酶解溫度設(shè)定為50℃，以黃芩素、漢黃芩素的含量及出膏率為考察指標，按如下水平以 L9(34)表進行試驗。因素水平見表2。

表2 正交試驗因素水平表

取黃芩藥材，粗碎成 0．5 cm以下的碎塊，稱取 500 g，按L9(34)正交表分別酶解提取，濾取懸浮液，煮沸10 min，冷卻，離心，收集沉淀，60℃烘干，即得黃芩苷元總提物。測定總提物中黃芩素、漢黃芩素的含量及出膏率，結(jié)果見表3。方差分析結(jié)果見表4至表6。

表3 正交試驗表及結(jié)果 L9(34)

表4 黃芩素方差分析結(jié)果

表5 漢黃芩素方差分析結(jié)果

表6 出膏率方差分析結(jié)果

直觀分析表明，以黃芩素的含量和出膏率為考察指標，各因素影響大小依次為A＞B＞C，最佳工藝為A3B3C3;以漢黃芩素的含量為指標，各因素影響大小依次為A＞C＞B，最佳工藝為A3B3C3。方差分析表明，提取次數(shù)對黃芩素含量及出膏率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，但提取2次和3次時，黃芩素的含量和出膏率均增加幅度較小，其他因素影響均不顯著，為省工節(jié)能，選擇加9倍水，酶解提取2次，時間為每次2 h，因此優(yōu)選工藝為A2B2C2。

2．2．3 驗證試驗

按最佳工藝A3B3C3與優(yōu)選工藝A2B2C2分別進行酶解提取，濾取懸浮液，離心后，烘干，測定出膏率及黃芩素和漢黃芩素含量，每種工藝平行試驗3次。結(jié)果最佳工藝中黃芩素的平均含量為66．56%，漢黃芩素含量為8．74%，出膏率為8．27%;優(yōu)選工藝黃芩素的平均含量為67．08%，漢黃芩素含量為8．65%，出膏率為8．06%。最佳工藝和優(yōu)選工藝各指標相差不大，但優(yōu)選工藝省工節(jié)能，利于產(chǎn)業(yè)化。

2．2．4 生產(chǎn)提取工藝確定

取黃芩藥材，破碎為0．5 cm以下的碎塊。按藥材質(zhì)量比，加9倍量的45～60℃水，在同一溫度下酶解提取2次，每次2 h，濾取懸浮液，煮沸10 min，靜置，離心，分取沉淀，60℃干燥或取沉淀物加適量水噴霧干燥，得黃芩苷元總提取物。采用高效液相色譜法測定總提取物中黃芩素、漢黃芩素的含量。

3 討論

目前黃芩苷元的提取依據(jù)的都是“相似相溶”的提取原理，即酶解后的黃芩素等苷元類，脫去了結(jié)合的糖，變成苷元類的脂溶性成分，不再溶于水，而溶于乙醇、氯仿、甲苯等有機溶劑中，所以都是將酶解后的黃芩藥材烘干后，以乙醇為提取溶劑，進行提取。

本方法在提取原理上有了新的改進，突破了多年來“相似相溶”的提取原則，以水為溶劑，采用“非相似相溶”的“固-液-固”提取方法。即固體原料、水溶解提取、酶解懸浮、隨即濾取固體總苷元的方法，使提取、酶解能持續(xù)不斷地進行，黃芩總苷元在不斷地被懸浮，分離，不但酶解、提取完全，而且酶解析出的苷元類盡快得到分離，解決了熱分解破壞的難題，苷元類產(chǎn)量大、純度高。

利用懸浮的苷元類為黃白細膩的沉淀，很易通過60目篩網(wǎng)，而黃芩碎塊和溶解的黃芩苷不被濾出的粒度和溶解度之差，及時地將析出的苷元類進行分離。本提取方法如同化學(xué)反應(yīng)式中，取走反應(yīng)產(chǎn)物，可促使化學(xué)反應(yīng)不斷向右也就是向最終產(chǎn)物方向進行，直至反應(yīng)完全一樣。巧妙之處就在于利用了苷元類的沉淀與黃芩藥材具有顯著的粒度之差，而與黃芩苷又具有明顯的溶解度之差，才得以順利實施。

本方法是以水為溶劑，利用黃芩自身所帶的酶，無任何外來添加物，綠色、環(huán)保、苷元類游離完全、破壞少、純度高，成本低，是一種適合于大生產(chǎn)的提取工藝。

[1]徐玉田．黃芩的化學(xué)成分及現(xiàn)代藥理作用研究進展 [J]．光明中醫(yī)，2010，25(3):544-545．

[2]高 燕，顧振綸，蔣小崗，等．黃芩素藥理學(xué)研究新進展 [J]．時珍國醫(yī)國藥，2010，21(7):1 765-1 767．

[3]劉太明，蔣學(xué)華．黃芩苷和黃芩素大鼠在體胃、腸的吸收動力學(xué)研究 [J]．中國中藥雜志，2006，31(12):999-1 001．

[4]劉志剛，顏仁梁，徐昌瑞，等．黃芩自生酶催化水解總黃酮苷的工藝研究 [J]．解放軍藥學(xué)學(xué)報，2008，24(2):130-132．

[5]王宏志，喻春皓，高 鈞，等．酶法提取黃芩中黃芩素和漢黃芩素[J]．中藥材，2007，30(7):851-854．

[6]李玉萍，劉建濤，熊向源，等．黃芩素的制備及抗糖尿病研究概況[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(32):15 648-15 651，15 654．

[7]李曉燕，趙韶華，韓桂茹．自身酶解法測定黃芩藥材中黃芩素和漢黃芩素的含量[J]．中國藥業(yè)，2012，21(9):10-11．