大黃素甲醚聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠MMP-9和TIMP-1蛋白酶的影響

李長(zhǎng)棟，荔志云，白 海，孫建軍，趙 強(qiáng)

顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是頭部受到暴力所造成的損傷，無(wú)論在平時(shí)或戰(zhàn)時(shí)，其發(fā)生率僅次于四肢傷，但在死亡傷員中占第一位，是死亡率最高的部位傷，一直是戰(zhàn)創(chuàng)傷救治的重點(diǎn)和難點(diǎn)。重型顱腦損傷所導(dǎo)致的重度殘疾和持續(xù)性植物狀態(tài)的有效治療也一直是困擾臨床醫(yī)生和科研工作者的難題［1］。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs)是一種來(lái)源于中胚層具有自我復(fù)制更新和多向分化的成體多能干細(xì)胞［2］。干細(xì)胞移植作為一項(xiàng)治療TBI新的手段近年來(lái)得到人們認(rèn)同［3］。其可通過(guò)多種途徑對(duì)腦損傷后血腦屏障破壞起著保護(hù)和修復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞的作用［4］。大黃素甲醚(physcion)為大黃中有效成分之一，文獻(xiàn)報(bào)道大黃素甲醚具有皮層神經(jīng)元神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用［5］、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用［6］、抗炎性因子和抗氧化作用［7］等。中藥對(duì)TBI后的神經(jīng)保護(hù)作用已有報(bào)道。前期研究表明，大黃素甲醚聯(lián)合HUCMSCs對(duì)腦損傷具有明顯保護(hù)作用。本研究運(yùn)用ELISA法，從腦組織微血管基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)變化方面，動(dòng)態(tài)觀察HUC-MSCs移植對(duì)腦損傷血腦屏障的保護(hù)作用，從其對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶變化的影響方面進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistat大鼠:體質(zhì)量200～250g，2～3月齡，雌雄不限;由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 主要儀器和試劑

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院血液病干細(xì)胞治療中心培養(yǎng));DAPI工作液(美國(guó)Sigma公司);低溫高速臺(tái)式離心機(jī)(UNIVERSAL116型，德國(guó)Hetaeus公司):倒置相差顯微鏡(CKX41-A32PH型，日本Olympus公司);細(xì)胞培養(yǎng)箱(NU-2700E型，德國(guó)NUAIR公司);潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD型，蘇州潔凈化設(shè)備有限公司);微量移液器(大龍醫(yī)療設(shè)備上海有限公司):水欲搖床(SBD50-1.610型，Heto公司);恒溫循環(huán)器(CBN8-30型，Heto公司);－80℃超低溫冰箱(MDF-381型，日本三洋有限公司);－20℃冰箱(BCD-218型，蘭州長(zhǎng)風(fēng)機(jī)器廠):電子天平(AG-135型，瑞士梅特勒公司);流式細(xì)胞檢測(cè)儀(E0675型，美國(guó)FACSCALIBUR公司);正置萬(wàn)能顯微鏡［20050929(ND-11D)，日本Olympus公司］;LG-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司);胎牛血清(FBS)(購(gòu)于浙江天杭生物科技有限公司);胰蛋白酶(購(gòu)于美國(guó)Amresco公司);抗體FITC-CD44、PE-CD45、PE-CD34(美國(guó)BD公司);大黃素甲醚(陜西信瑞生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào):SR-20100902);ELISA試劑盒(上海博邁生物科技有限公司)，金屬蛋白酶-9及金屬蛋白酶組織抑制因子-1(上海博邁生物科技有限公司)。

3 TBI動(dòng)物模型的建立與實(shí)驗(yàn)步驟

將40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(10只)、TBI組(10只)、HUC-MSCs移植組(10只)、HUC-MSCs移植+大黃素甲醚組(10只)。對(duì)TBI組(10只)、HUC-MSCs移植組(10只)、HUC-MSCs移植+大黃素甲醚組(10只)大鼠進(jìn)行TBI模型制備，體積分?jǐn)?shù)為10%水合氯醛按3ml/kg體重腹腔麻醉后，采用改良Feeney法建立自由落體撞擊造成閉合性顱腦損傷(一根長(zhǎng)50cm、直徑2.5cm的鋼管和重500g的天平砝碼)，致傷后大鼠出現(xiàn)四肢抽搐，呼吸暫停數(shù)秒，術(shù)后昏迷時(shí)間2～10h說(shuō)明致傷成功。HUCMSCs移植組、聯(lián)合組20只大鼠在制模結(jié)束24h后，將HUC-MSCs 2.0×106個(gè)細(xì)胞懸液0.5ml通過(guò)大鼠尾靜脈植入。聯(lián)合組大鼠在移植細(xì)胞2～4h開(kāi)始予大黃素甲醚干預(yù)，用藥劑量40mg/(kg·d)灌胃，共用藥2周。

4 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定

本實(shí)驗(yàn)?zāi)７慢R凱等［8］的方法進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、分離和純化。取對(duì)數(shù)期P3代細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，配制成濃度為10×106/ml的細(xì)胞懸液，每個(gè)Eppendorf管加100μl的細(xì)胞懸液，每種抗體設(shè)置2個(gè)復(fù)管，分別加入20μlFITC-CD44、PE-CD45、PE-CD34，對(duì)照管分別加入等量相對(duì)應(yīng)的FITC-IgG1和PE-IgG1，冰上避光孵育30min，PBS洗滌2次，250g離心5min，重新制備細(xì)胞懸液，經(jīng)400目細(xì)胞篩過(guò)6濾，流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)上機(jī)檢測(cè)，F(xiàn)ACS分析，記數(shù)10細(xì)胞，CellQuest軟件分析結(jié)果。

5 取材與處理

對(duì)照組和TBI組大鼠在模型制備48h、14d、21d、28d后分批取腦;HUC-MSCs移植組、HUCMSCs移植+大黃素甲醚組大鼠在細(xì)胞移植21d斷頭取腦，將標(biāo)本分為2份。一份用于HE染色病理學(xué)觀察(各組自前囟處開(kāi)始作冠狀位切片，隔5取1，至海馬結(jié)構(gòu)行蘇木精-伊紅染色，每個(gè)腦標(biāo)本選取海馬相同位置非連續(xù)層面5處，每一層面處連續(xù)切片3張);一份將腦組織使用勻漿器勻漿后取上清液用于ELISA法檢測(cè)。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

HUC-MSCs流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原發(fā)現(xiàn)，MSC的標(biāo)志抗原CD45表達(dá)陽(yáng)性，白細(xì)胞標(biāo)志抗原CD44和造血前體細(xì)胞標(biāo)志抗原CD34均表達(dá)陰性，證實(shí)該細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(圖1)。

對(duì)照組大鼠腦組織中MMP-9表達(dá)較強(qiáng)，模型組較對(duì)照組減弱(P＞0.05)。與TBI模型組比較，HUC-MSCs移植組和HUC-MSCs移植組+大黃素甲醚組大鼠腦組織中MMP-9表達(dá)減弱(P＜0.01)。對(duì)照組大鼠腦組織中TIMP-1表達(dá)明顯，模型組大鼠腦組織中TIMP-1表達(dá)減弱(P＜0.01)。HUC-MSCs移植組和HUC-MSCs移植組+大黃素甲醚組大鼠腦組織中TIMP-1表達(dá)均較TBI模型組增強(qiáng)(P＜0.01)，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 HUC-MSCs表達(dá)CD44，純度可達(dá)99%以上，不表達(dá)造血干細(xì)胞表型CD34和CD45

表1 各組大鼠腦組織中TIMP-1和MMP-9表達(dá)(±s，OD×10－2)

表1 各組大鼠腦組織中TIMP-1和MMP-9表達(dá)(±s，OD×10－2)

與對(duì)照組比較:△P＜0.01，#P＜0.01;與TBI模型組比較:#P＜0.01;與HUC-MSCs移植組比較:△P＜0.05;TBI組于對(duì)照組比較:◆P＞0.05，*P＜0.01

組別 n MMP-9陽(yáng)性表達(dá)TIMP-1陽(yáng)性表達(dá)正常對(duì)照組6 36.81±0.04 66.85±0.04 TBI模型組 6 35.81±0.02◆ 42.95±0.05*HUC-MSCs移植組6 22.95±0.02# 47.01±0.05#HUC-MSCs移植組+6 23.53±0.03△ 44.78±0.05△大黃素甲醚組

討 論

大黃是一味應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)中藥，主要藥理作用包括:致瀉、保肝、止血、利尿、抗炎，抑制細(xì)胞凋亡等［9－11］。大黃素甲醚(physcion)為大黃中有效成分之一，具有皮層神經(jīng)元神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用［12］、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用［13］、抗炎性因子和抗氧化作用［14］等。TBI后繼發(fā)性缺血再灌注損傷可引起血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)破壞，導(dǎo)致腦部毛細(xì)血管通透性的增加，加重腦水腫［15］。BBB對(duì)于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有非常重要的意義。對(duì)于BBB損傷的機(jī)制很多，其中原因之一為基質(zhì)金屬酶對(duì)毛細(xì)血管基底膜的降解［16］。創(chuàng)傷性腦損傷可激活MMP-9降解為細(xì)胞外成分，引起B(yǎng)BB的破壞，MMP-9為血管源性水腫和繼發(fā)性腦損傷的重要因素［17］;TIMP-1是MMP-9的天然特異性抑制劑，在腦損傷中TIMP-1的作用主要是與MMP-9特異性結(jié)合，其中TIMP-1可選擇性抑制MMP-9，阻斷MMP-9對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解。腦損傷可激活MMP-9，引起MMP-9和TIMP-1失衡，造成血腦屏障破壞［18］。因此，腦損傷后通過(guò)調(diào)節(jié)明膠酶系統(tǒng)失衡可發(fā)揮血腦屏障保護(hù)作用。其作用機(jī)制可能為:(1)通過(guò)抑制AQP-4基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，改善血腦屏障損傷減輕腦水腫的作用;(2)增加基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)表達(dá)以調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)平衡，可使腦缺血再灌注損傷大鼠微血管基底膜Ⅳ型膠原(typeⅣcollagen，colⅣ)降解減少，通透性降低，減輕腦水腫，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

本研究顯示，TBI后MMP-9表達(dá)明顯增強(qiáng)，HUC-MSCs移植可明顯減弱腦組織MMP-9、增強(qiáng)TIMP-1表達(dá);大黃素甲醚+HUC-MSCs移植組大鼠腦內(nèi)TIMP-1表達(dá)顯著增強(qiáng)，認(rèn)為大黃素甲醚可能是通過(guò)上調(diào)HUC-MSCs移植后TIMP-1水平以調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶失衡，進(jìn)而減輕微血管基底膜膠原降解以發(fā)揮對(duì)血腦屏障保護(hù)的促進(jìn)作用。

［1］Yu F，Morshead CM.Adult stem cells and bioengineering strategies for the treatment of cerebral ischemic stroke［J］.Curr Stem Cell Res Ther，2011，6(3):190－207.

［2］哈承志，王大偉.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在骨組織工程中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國(guó)組織工程研究，2012，16(1):158－162.

［3］Ding DC，Shyu WC，Lin SZ.Mesenchymal stem cells［J］.Cell Transplant，2011，20(1):5－14.

［4］Pelosi E，Castelli G，Testa U.Human umbilical cord is a unique and safe source of various types of stem cells suitable for treatment of hematological diseases and for regenerative medicine［J］.Blood Cells Mol Dis，2012，49(1):20－28.

［5］蘇鉅年，賴永長(zhǎng)，皮婷，等.大黃素甲醚對(duì)體外新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)作用［J］.中成藥，2011，33(10):1790－1793.

［6］張明，荔志云，趙紅斌，等.大黃素甲醚對(duì)神經(jīng)細(xì)胞缺氧性損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志，2012，33(2):106－110.

［7］Ma BL，Ma YM，Yan DM，et al.Effective constituents in Xiexin Decoction for anti－inflammation［J］.J Ethnopharmacol，2009，125(1):151－156.

［8］齊凱，董麗媛，陳顯久，等.人臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的優(yōu)化［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(23):4220－4224.

［9］Sheng X，Wang M，Lu M，et al.Rhein ameliorates fatty liver disease through negative energy balance，hepatic lipogenic regulation，and immunomodulation in diet－induced obese mice［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2011，3(3):886－893.

［10］Rajkumar V，Guha G，Ashok Kumar R.Antioxidant and anti－cancer potentials of rheum emodi rhizome extracts［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2011，697986.

［11］Chang MH，Chang SC，Chan WH.Injurious effects of emodin on maturation of mouse oocytes，fertilization and fetal development via apoptosis［J］.Int J Mol Sci，2012，13(11):13911－13925.

［12］Yang EJ，Min JS，Ku HY，et al.Isoliquiritigenin isolated from Glycyrrhiza uralensis protects neuronal cells against glutamate－induced mitochondrial dysfunction［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，421(4):658－664.

［13］Hwang C，Kchun HS.Isoliquiritigenin isolated from licorice Glycyrrhiza uralensis prevents 6－h(huán)ydroxydopamine－induced apoptosis in dopaminergic neurons［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2012，76(3):536－543.

［14］Cho N，Choi JH，Yang H，et al.Neuroprotective and antiinflammatory effects of flavonoids isolated from Rhus verniciflua in neuronal HT22 and microglial BV2 cell lines［J］.Food Chem Toxicol，2012，50(6):1940－1945.

［15］Shin JW，Kang HC，Shim J，et al.Scutellaria baicalensis attenuates blood－brain barrier disruption after intracerebral hemorrhage in rats［J］.Am J Chin Med，2012，40(1):85－96.

［16］Barr TL，Latour LL，Lee KY，et al.Blood－brain barrier disruption in humans is independently associated with increased matrix metalloproteinase－9［J］.J Cereb Circulation，2010，41(3):123－128.

［17］Hosokawa T，Nakajima H，Doi Y，et al.Increased serum matrix metalloproteinase－9 in neuromyelitis optica:implication of disruption of blood－brainbarrier［J］.J Neuroimmunol，2011，(6):81－86.

［18］Ralay Ranaivo H，Hodge JN，Choi N，et al.Albumin induces upregulation of matrix metalloproteinase－9 in astrocytes via MAPK and reactive oxygen species－dependent pathways［J］.J Neuroinflamm，2012，(9):67－68.